肠道铁水平在放射性肠损伤中的作用及去铁铵对结肠癌细胞的放疗增敏机制初探

作     者：毛久昂 

作者单位：苏州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王振欣

授予年度：2021年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：放射性肠损伤 Tmprss6 铁代谢 去铁铵 结肠癌 放疗增敏 EMT 

摘      要：第一部分Tmprss6基因敲除在放射性肠损伤中的作用研究目的:研究TMPRSS6基因对小鼠放射性肠损伤的影响并探索可能的机制。方法:7-8周龄雄性野生型（WT）小鼠和TMPRSS6基因敲除（KO）小鼠随机分成非辐照组和辐照组,其中辐照组采用11.5 GyX射线全腹部照射建立放射肠损伤模型。H＆E染色和TUNEL染色分别观察不同肠段病理损伤和凋亡情况。测量不同肠段辐照前后铁、SOD、GSH、T-AOC和MDA含量,并进行相关性分析。结果:TMPRSS6-/-小鼠相较于WT小鼠全腹辐照后十二指肠部位损伤和凋亡加重,表现为TMPRSS6-/-小鼠的十二指肠绒毛长度和隐窝计数显著下降,TUNEL+细胞数显著增加,差异有统计学意义。WT和TMPRSS6-/-小鼠十二指肠部位铁含量在辐照后3.5天和7天相较于辐照前呈现持续升高的趋势;并且TMPRSS6-/-组辐照后3.5天和7天相较于WT组均有显著的升高。另外,在辐照后的3.5天和7天,TMPRSS6-/-小鼠十二指肠部位SOD、GSH、T-AOC相较于WT组均显著下降,而MDA则显著升高。相关性分析结果提示,KO组十二指肠MDA、SOD和T-AOC水平与其铁含量显著相关。结论:小肠铁水平与辐照诱导的氧化应激具有显著相关性;Tmprss6基因敲除小鼠表现为十二指肠铁累积和辐照诱导的氧化应激加剧,Tmprss6基因缺失在十二指肠放射损伤中具有增敏作用。第二部分铁在放射性肠损伤中的作用及其机制研究目的:研究柠檬酸铁铵（FAC）在电离辐射诱导的小肠上皮细胞（HIECs）损伤中的作用及其机制;通过建立低铁饮食小鼠的放射肠损伤模型,评价肠道低铁水平对放射性肠损伤的保护作用,并进一步探讨其作用机制。方法:将HIECs分别进行梯度浓度的FAC单独处理、不同剂量X射线电离辐射（IR）单独处理、FAC（200nM）和 IR（12Gy）共处理、FAC（200nM）和 IR（12 Gy）及铁死亡抑制剂Liproxstatin-1（Lip-1,200 nM）或铁螯合剂去铁铵（DFO,5 μM）共处理。CCK-8检测处理后0-48 h HIECs细胞增殖活力。C11-BODIPY荧光探针流式检测细胞脂质ROS。分离并培养小鼠肠道类器官,给予FAC（200μM）、IR（12 Gy）、DFO（5 μM）单独或共同处理,评估隐窝生长情况。4周龄小鼠接受缺铁或铁充足饲料饮食3-4周后,分别随机分成辐照组和非辐照组。辐照组采用11.5 Gy X射线全腹部照射（TAI）,建立正常饮食和低铁饮食小鼠的放射肠损伤模型并观察记录各组小鼠体重变化。Western blot检测小鼠小肠组织二价金属离子转运体（DMT1）和铁蛋白重链（FTH）蛋白表达水平。实时定量PCR检测铁调素基因（HAMP）mRNA和前列腺素内过氧化物合酶2（Ptsg2）mRNA表达水平。H＆E组织切片染色评估小肠组织病理损伤情况。检测各组小鼠小肠组织SOD、GSH、MDA水平用于评估小肠组织抗氧化能力。免疫组织化学染色检测小肠组织Ki67蛋白用于评估小肠隐窝细胞增殖活力。TUNEL法免疫荧光染色检测小肠肠隐窝细胞凋亡情况。结果:FAC或IR单独处理对HIECs增殖活力影响较小,且仅仅轻度诱导脂质ROS。FAC和IR共处理显著降低了 HIECs增殖活力,诱导脂质ROS大量累积,并且以上作用可以被Lip-1和DFO抑制。FAC在体外增强了小肠隐窝类器官放射敏感性,显著抑制辐射后隐窝生长,该效应可以被DFO逆转。TAI后一周内小鼠血清铁无显著变化,小鼠小肠组织DMT1蛋白表达增加;FTH在TAI后第3天下降,并在第7天恢复;TAI后第1天和第3天,铁调素基因的表达显着增加,并在第7天下降至正常水平。放射性肠损伤小鼠模型中观察到,与正常饮食组小鼠比较,低铁饮食小鼠TAI后体重损失减少、小肠组织病理损伤减轻,小肠SOD及GSH水平增加,而MDA含量和Ptgst2 mRNA表达减少。Ki67蛋白免疫组化和TUNEL荧光染色实验显示,低铁饮食可以改善辐照后小肠隐窝细胞增殖活力,有效抑制小肠隐窝细胞辐照后凋亡。结论:FAC可以协同IR诱导HIECs脂质过氧化铁死亡。肠道低铁水平可以改善电离辐射后小肠组织抗氧化能力,增强小肠隐窝细胞增殖活力并抑制其凋亡。第三部分去铁铵对结肠癌细胞株的放疗增敏作用及机制初探目的:评价去铁铵（Deferoxamine,DFO）对结肠癌细胞株SW480和HT29放射增敏的作用效果,并对其机制进行初步探索。方法:通过CCK-8法检测细胞增殖活力,观察不同浓度或剂量的DFO（5、10、20、50、100μM）和电离辐射（IR,4、8、12 Gy）对人结肠癌细胞株SW480及HT29的杀伤效应,并确定最终适用的DFO浓度和IR剂量。将细胞分为未处理对照组（NC）、DFO（10μM）处理组、IR（4Gy）处理组,以及DFO（10 μM）和IR（4 Gy）共处理组。Western blot检测各组细胞铁代谢相关蛋白DMT1、FPN1、FTH和FTL蛋白表达水平,上皮间质转化（EMT）相关蛋白SNAI1、Vimentin、E-cadherin表达水平。结果:不同浓度的 DFO（5、10、20、50、100 μM）或 IR（4、8、12 Gy）处理24、48小时后,HT29和SW480细胞增殖活力均呈时间依赖和浓度/剂量依赖的方式降低,差异均具有统计学意义（p0.05）。与单独辐照相比,高浓度的DFO（50或100μM）与大剂量IR（12 Gy）共处理可以强烈抑制SW480和HT29细胞增殖活力（p0.05）。与4Gy单独辐照相比较,5 μMDFO与4 Gy X射线辐照共处理24、48小时后,SW480细胞活力抑制率分别增长了 14.46%和21.88%,HT29细胞活力抑制率分别增长了 8.3%和8.4%;10 μM DFO与4 Gy X射线辐照共处理24、48小时后,SW480细胞活力抑制率分别增长了 25.90%和50.42%,HT29细胞活力抑制率分别增长了 7.9%和35.1%。Western blot结果显示,SW480细胞在DFO或IR单独或联合处理后DMT1、FPN1、FTH和FTL蛋白表达量较NC组均增加。其中,IR处理组DMT1表达水平最高,并且可以被DFO逆转。HT29细胞各处理组DMT1、FPN1蛋白的表达变化与SW480细胞基本一致,但FTH、FTL蛋白表达水平与NC组相比整体下降。在SW480细胞中,DFO或IR处理后SNAI1、Vimentin蛋白表达较NC组增加,E-cadherin的表达降低;然而,DFO与IR联合处理逆转了这一结果。在HT29细胞中,SNAI1蛋白在所有处理组中表达均降低,E-cadherin蛋白表达均增加。两个肠癌细胞辐照处理组Vimentin蛋白表达增加,并被DFO逆转。结论:DFO或IR可以诱导人结肠癌细胞SW480和HT29细胞表现为促铁摄取表型。DFO可以增加SW480和HT29放射敏感性,并协同IR显著抑制SW480和HT29细胞EMT表型。