调控突触囊泡蛋白2A对耐药性颞叶癫痫大鼠海马神经元发生PARP-1依赖性细胞死亡的影响

作     者：张淑敏 

作者单位：贵州医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：伍国锋

授予年度：2021年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100204[医学-神经病学] 10[医学] 

主      题：突触囊泡蛋白2A 颞叶癫痫 耐药性 海马 PARP-1依赖性细胞死亡 

摘      要：目的:探讨通过调控突触囊泡蛋白2A(Synaptic vesicle protein 2A,SV2A)的表达,对耐药性颞叶癫痫大鼠海马神经元发生多聚ADP核糖聚合酶-1(Poly(ADP-ribose)polymerase-1,PARP-1)依赖性细胞死亡的影响。方法:健康成年雄性SD大鼠共150只,从中随机抽取6只作为正常对照组,剩余大鼠用于制备癫痫模型。使用氯化锂-匹罗卡品联合用药诱导大鼠进入癫痫持续状态,制备氯化锂-匹罗卡品急性癫痫模型。待造模成功大鼠进入慢性癫痫期,出现自发性反复癫痫发作的大鼠即为慢性癫痫大鼠,予苯巴比妥、苯妥英钠2种抗癫痫药物进行腹腔注射治疗,持续14天,通过对比使用药物治疗前和治疗后大鼠癫痫发作减少的情况,筛选出药物敏感性癫痫大鼠和耐药性癫痫大鼠,分别纳入药敏组和耐药组。对筛选出的耐药性癫痫大鼠使用SV2A上调慢病毒进行过表达调控,纳入SV2A上调组;使用SV2A下调慢病毒进行干扰调控,纳入SV2A下调组;注射对应空载体病毒作为上调阴性对照和下调阴性对照。分别纳入SV2A上调阴性对照组和SV2A下调阴性对照组。对各组大鼠脑组织取材,进行免疫荧光和蛋白免疫印迹实验,通过检测PARP-1和AIF等蛋白定位及表达情况,观察耐药性颞叶癫痫大鼠海马神经元发生PARP-1依赖性细胞死亡(Parthanatos)的变化。结果:(1)与药敏组大鼠相比,耐药组大鼠的癫痫自发发作频率增加(T=-7.869,P0.05),发作等级较药敏组更高(T=-3.154,P=0.010),发作持续时间更长(T=-2.816,P=0.018)。与SV2A上调对照组相比,SV2A上调组大鼠自发性癫痫的发作频率减少(T=3.461,P=0.026),发作时间明显缩短(T=2.848,P=0.047),发作等级差异不显著(T=1.555,P=0.195)。与SV2A下调对照组大鼠相比较,SV2A下调组大鼠经过慢病毒敲低干扰调控后,癫痫自发性发作的频率增加(T=-2.940,P=0.042),发作等级和发作持续时间无明显差异(T=-0.288,P=0.788;T=-0.204,P=0.848)。(2)免疫荧光结果显示:PARP-1在海马齿状回主要存在于颗粒细胞的细胞核内,正常、药敏、耐药三组之间PARP-1的平均荧光强度不完全一致,差异具有统计学意义(F=11.273,P=0.001)。事后两两比较发现,耐药组、药敏组大鼠PARP-1的平均荧光强度相比正常组显著增强(P0.05),且耐药组的平均荧光强度较药敏组更强(P0.05)。WB结果显示:三组大鼠间PARP-1的表达量具有显著差异(F=40.839,P0.05),药敏组和耐药组大鼠海马PARP-1表达较正常组明显增加(P0.05),且耐药组较药敏组表达更高(P0.05)。(3)免疫荧光结果显示:AIF在正常组中,主要表达于齿状回颗粒细胞的细胞质内。药敏组AIF部分在胞质表达,小部分在胞核内有表达。耐药组中,AIF表达部位由胞质转向胞核,大量表达于细胞核内。三组间平均荧光强度差异具有统计学意义(F=4.313,P=0.037),耐药组与正常组相比明显增强(P0.05),耐药组与药敏组及药敏组与正常组间差异不显著。免疫印迹也得到了相似的结果:三组间具有差异(F=13.448,P=0.002),耐药组AIF的表达量显著高于正常组和药敏组(P0.05),药敏组与正常组间无显著差异。(4)SV2A慢病毒处理后各组大鼠PARP-1荧光强度不完全相同(F=5.089,P=0.011),SV2A上调对照组、SV2A下调对照组及SV2A下调组平均荧光强度较正常组增强(P0.05)。与SV2A上调对照组相比,SV2A上调组PARP-1平均荧光强度明显降低(P0.05);各组间PARP-1在海马中的表达量也具有差异(F=18.592,P0.05)。SV2A上调对照组、SV2A下调对照组及SV2A下调组中,海马PARP-1的表达高于正常组(P0.05)。SV2A上调组与SV2A上调对照组相比,PARP-1表达量减少(P0.05)。(5)SV2A病毒处理组大鼠AIF免疫荧光结果示(F=4.406,P=0.018),SV2A上调对照组、SV2A下调对照组和SV2A下调组中,AIF在海马齿状回的平均荧光强度明显高于正常组大鼠(P0.05),但SV2A上调组与SV2A上调对照组间及SV2A下调组与SV2A下调对照组间,差异无统计学意义。WB结果示(F=8.509,P=0.003),SV2A上调对照组、SV2A下调对照组和SV2A下调组中AIF的表达量明显高于正常组(P0.05)。与SV2A下调组相比,SV2A上调组大鼠海马AIF表达量明显降低(P0.05)。其余组间差异不显著。结论:(