猪霍乱沙门菌噬菌体的分离鉴定及其黏附肠上皮特性和对肠道保护作用的研究

作     者：张玉宇 

作者单位：南京农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：黄赞

授予年度：2020年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：沙门菌噬菌体 肠道 黏附特性 抑菌作用 

摘      要：沙门菌可黏附于肠道上皮,侵犯黏膜免疫系统并释放内毒素,导致仔猪腹泻,增加腹泻仔猪的死亡率,而抗生素治疗的负面效应日益严重。噬菌体作为感染细菌的病毒,是最有潜力的绿色替抗产品之一,有研究表明噬菌体可黏附于上皮细胞抵抗细菌侵袭,但目前肠道噬菌体对肠黏膜的保护效果还不清楚。因此,本研究针对沙门菌引起仔猪腹泻的问题,从猪肠道中分离鉴定沙门菌噬菌体,并研究噬菌体黏附肠上皮的特性以及黏附后对肠上皮的保护作用。本研究为仔猪腹泻预防措施的制订提供新思路并为噬菌体成为一种新型抗生素替代品提供研究基础。本研究主要进行了以下工作:1.猪霍乱沙门菌噬菌体的分离及其生物学特性分析本研究以*** 13122为指示菌,从两个猪场的40份猪肠道食糜和黏膜样品中分离得到3株噬菌体,命名为沙门菌噬菌体L6jm、S19cd及Lv5cm。对3株噬菌体进行了全基因组测序和电镜观察,测定了其宿主谱、成斑率,pH及热稳定性,最佳感染复数、一步生长曲线和抑菌效力等生物学特性。结果显示:L6jm可跨属感染1株大肠杆菌*** 244,此外还可裂解9株大肠杆菌其中包括1株ETEC;S19cd可跨属感染2株大肠杆菌*** 44和*** 172,此外还可裂解7株大肠杆菌;Lv5cm可裂解2株大肠杆菌但均无法感染。3株噬菌体在*** 13122上的最佳感染复数分别为10-2、10-6和10-2。3株噬菌体对环境的耐受能力较强,均可在不高于50℃时,pH值为3-11时维持活性。3株噬菌体在液体LB培养基中均对*** 13122有显著的抑菌效果（P0.05）,且L6jm在MOI为100时对ETEC 104有显著（P0.05）的抑菌效果。2.体外研究噬菌体黏附肠道上皮的特性及其抑菌作用为探究噬菌体在肠道上皮的黏附特性及抑菌作用,选择IPEC-1、Caco-2及MDCK细胞系进行体外试验。结果显示:与不产黏液的MDCK细胞相比,3株噬菌体均可且更倾向黏附于产黏液的肠上皮（IPEC-1和Caco-2）细胞;不同噬菌体之间黏附能力不同,噬菌体L6jm和S19cd在三个细胞系上的黏附数量均显著（P0.05）高于Lv5cm。噬菌体以松散连接的方式黏附于肠上皮细胞,黏附的数量与接种的噬菌体数量呈现剂量依赖性。进一步测定噬菌体预先黏附于IPEC-1细胞抵抗*** 13312侵袭的保护效果,结果表明噬菌体S19cd和Lv5cm黏附于细胞后均可显著（P0.05）降低细胞培养液中以及黏附于细胞上的细菌数量,且S19cd的抑菌效果优于Lv5cm,但是L6jm则无抑菌效果。为了探究是否是营养条件影响了噬菌体L6jm的抑菌效果,测定了 3株噬菌体在有无CO2和LB以及DMEM/F12培养基里的抑菌效果,发现这些不同的营养条件对S19cd及Lv5cm抑菌效果的影响差异不显著（P0.05）,但DMEM/F12培养基会使L6jm失去抑菌能力,说明营养条件会影响某些噬菌体与细菌之间的互作。同时在噬菌体抑菌过程中分离鉴定得到对噬菌体产生抗性的突变菌5株,其中一株突变菌ST12的生长能力显著（P0.05）低于*** 13312。3.体内研究噬菌体黏附肠上皮的特性及其抑菌作用为进一步探究噬菌体在体内的黏附特性和保护效果,选择6周龄的Balb/c小鼠进行体内实验。结果显示:噬菌体S19cd及Lv5cm在灌胃后8h即已随粪便大量排出,但仍可在小肠黏膜食糜中检测到噬菌体,且黏膜噬菌体数量显著（P0.05）高于食糜。以“黏膜噬菌体计数/食糜噬菌体计数比较两株噬菌体的黏附能力,结果发现噬菌体S19cd和Lv5cm在小肠内的黏附能力差异不显著（P0.05）。进一步测定预先灌胃噬菌体对*** 13312侵袭的抵抗能力,结果显示预先灌胃噬菌体S19cd可显著（P0.05）缓解Scholeraesuls 13312侵袭所造成的体重下降。