棉花抗黄萎病相关基因CHI32和GLU43的功能分析

作     者：柳汉桥 

作者单位：南京农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张大勇

授予年度：2020年

学科分类：09[农学] 0904[农学-植物保护] 090401[农学-植物病理学] 090402[农学-农业昆虫与害虫防治] 

主      题：棉花 黄萎病菌 几丁质酶 β-1,3-葡聚糖酶 转基因材料 原核表达 亚细胞定位 

摘      要：棉花(Gossypium spp.)是世界上最重要的经济作物之一,是世界上重要的天然纤维和油料的来源。黄萎病(Verticillium dahliae)是由土传真菌大丽轮枝菌引起的一种严重的维管病害。棉花受到黄萎病侵染后叶片失绿变黄、萎蔫脱落,甚至造成植株死亡,严重制约了其产量及纤维品质。棉花黄萎病的根治问题一直是农业科学的一大难题。陆地棉(Gossypium hirsutum L.)和海岛棉(Gossypium barbadense L.)是两大四倍体栽培棉种,与陆地棉相比,海岛棉抗病能力较强。本试验室前期从海岛棉海7124中克隆出两个抗病相关基因,分别为编码几丁质酶的CHI32和β-1,3-葡聚糖酶的GLU43。本研究进一步对这两个基因的抗病特征进行分析,并运用基因工程的手段创制相关转基因材料,为深入研究CHI32和GLU43参与抗病分子机理及育种利用提供思路和材料。主要研究结果如下:***32和GLU43参与黄萎病抗性的特征分析分 别 构 建 pET30a(+)-CHI32、pGEX4P-CHI32、pCOLDTF-CHI32,pET30a(+)-GLU43、pGEX4P-GLU43、pCOLDTF-GLU43共6 个原核表达载体,比较了这三个载体的优缺点。pET30a(+)含有一个HIS标签,载体简单,但可溶性蛋白表达较差;pGEX4P带有一个GST标签,标签较大,但可溶性蛋白表达比pET30a(+)强;pCOLDTF带有一个分子伴侣TF及一个HIS标签,标签最大,但可溶性蛋白表达最强。利用pGEX4P-CHI32诱导并纯化出带有GST标签的CHI32蛋白;利用pCOLDTF-GLU43诱导并纯化出带有HIS标签的GLU43蛋白。对纯化的目的蛋白通过Western Blot分析,证明原核蛋白表达正确。利用纯化的目的蛋白进行体外大丽轮枝菌抑菌试验,明确GLU43比CHI32蛋白有更好的体外抑菌效果。亚细胞定位表明,CHI32和GLU43均定位在细胞膜上或膜周围。进一步构建CHI32酵母双杂载体,并对棉花受黄萎病诱导的cDNA酵母表达文库进行筛选,发现CHI32与一个超敏反应蛋白GB07G0713相互作用,为进一步功能解析CHI32作用机理奠定基础。***32和GLU43转基因材料创制从海岛棉海7124中克隆CHI32和GLU43的全长ORF序列,分别构建pBI 121-CHI32和pBI121-GLU43两个过量表达载体,pART27-CHI32和pART27-GLU43两个干扰载体。将过量表达载体转入拟南芥中,分别创制过量表达CHI32和GLU43的转基因拟南芥材料。通过提取基因组DNA进行目标基因的PCR鉴定,分别获得转CHI32的转基因拟南芥C34、C52、C35、C51、C41、C47六个阳性株系,转GLU43的转基因拟南芥G5、G1、G7、G11、G9、G16、G3、G6八个阳性株系。分别提取根、茎、叶等组织的RNA,进行外源基因表达水平鉴定,证明转基因株系中CHI32和GLU43的表达量分别较野生型均显著提高。将过量表达载体和干扰载体转入棉花中,创制CHI32和GLU43过量表达和干扰表达的转基因棉花材料。其中通过基因组DNA的初步PCR鉴定,共获得过量表达CHI32的转基因棉花 T3 代 CC4、CC105、CC138、CC147、CC172、CC183 和 T2 代CC92、CC93、CC107、CC135、CC193、CC209,共 12 个转基因阳性株系;获得过量表达GLU43的转基因棉花T3代CG29、CG149、CG172和T2代CG82、CG54、CG55、CG87、CG165、CG167、CG949,共10个转基因阳性株系;目前转基因棉花干扰材料还在植物组织培养阶段,部分已培育出T0代组培小苗。