DDX5蛋白抑制宿主先天性免疫的初步研究

作     者：马振邦 

作者单位：江西农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王萍;李永清

授予年度：2021年

学科分类：090602[农学-预防兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：先天性免疫 DEAD-box解旋酶 DDX5 METTL3 IFN-β 

摘      要：宿主细胞DEAD-box(DDX)家族蛋白是一种结构高度保守且数量众多的RNA解旋酶,主要参与宿主细胞基因的转录调控。然而,近年来的研究表明,DDX家族蛋白还参与宿主的先天性免疫反应,在I型干扰素(IFN-I)的产生及炎症反应方面发挥重要作用。DDX5蛋白是DDX家族的重要成员,其不仅在细胞生长发育及肿瘤发生发展中发挥作用,而且在多种病毒的感染过程中影响病毒的复制。然而其作用机制尚不清楚,我们在前期研究中发现,MDV可以调控宿主DDX5蛋白来抑制宿主先天性免疫反应,并促进病毒在鸡胚成纤维细胞上的生长,这表明DDX5在禽类先天性免疫过程中发挥重要作用。然而,DDX5是否在哺乳动物先天性免疫过程中发挥同样的作用尚未见报道。为了进一步证实DDX5蛋白调控哺乳动物的先天性免疫反应。本研究采用水疱性口炎病毒(VSV)分别感染DDX5基因敲降或过表达的小鼠成纤维细胞,通过测定病毒诱导的IFN-β和IL-6 m RNA转录水平、细胞上清IFN-β和IL-6的含量及对病毒复制的影响,结果发现DDX5显著性抑制病毒感染后IFN-β和IL-6的产生并增强病毒的复制,研究表明DDX5在先天性免疫中作为一个负抗病毒调节因子来抑制病毒感染后IFN-β和IL-6的产生并且促进病毒的复制;采用CRISPR/Cas9技术构建DDX5基因缺失小鼠,对其后代与野生型后代小鼠使用VSV与仙台病毒(Se V)进行攻毒实验,通过ELISA测定比较两种不同小鼠巨噬细胞培养上清和血清中IFN-β和IL-6的分泌量,并测定小鼠体内器官(肺、肝、脾)中病毒的复制滴度,同时进行组织病理学分析,结果显示病毒感染后,DDX5小鼠相对于野生型子代小鼠,血清中IFN-β和IL-6的产量显著增加,并且DDX5小鼠的肺间质性肺炎较少,肝脏损伤较轻,脾脏病变较少,研究表明DDX5蛋白在小鼠体内通过负调控先天性免疫,促进病毒复制并加强了病毒导致的组织损伤;为进一步探索作用机制,通过Pull down和Co-IP实验筛选鉴定出与DDX5相互作用的宿主蛋白靶蛋白METTL3,通过分析DDX5/METTL3的结构域,分别构建DDX5截短体和METTL3截短体鉴定蛋白相互作用的功能域,结果发现DDX5与METTL3之间的分子相互作用需要有METTL3的N端结构域和DDX5的P68HR结构域,研究证实DDX5通过其P68HR区域和METTL3的N端相互作用。综上所述,我们首次证明DDX5蛋白在哺乳动物细胞内负调控IFN-β和IL-6的产生,其通过P68HR结构域与宿主细胞METTL3蛋白的N端区域相互作用。研究结果不仅为DDX5在病毒感染先天性免疫过程中的作用机制的研究提供基础,也为新型的抗病毒药物研发提供潜在靶点。