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miRomics and proteomics reveal a miR-296-3p/PRKCA/FAK/Ras/c-Myc feedback loop modulated by HDGF/ddx5/β-catenin complex in lung adenocarcinoma

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2017年中国肿瘤标志物学术大会暨第十一届肿瘤标志物青年科学家论坛

作者： Qiaofen Fu Xin Song Zhen Liu Xiaojie Deng Rongcheng Luo Chunlei Ge Ruilei Li Zhen Li Mengyang Zhao Yiyu Chen Xian Lin Qianbing Zhang Weiyi Fang Cancer Center Integrated Hospital of Traditional Chinese MedicineSouthern Medical University Cancer Research Institute of Southern Medical University Department of Cancer Biotherapy Center Third Affiliated Hospital of Kunming Medical University (Tumor Hospital of Yunnan Province) Key Laboratory of Protein Modification and Degradation School of Basic Medical Sciences

Purpose: This study was performed to identify the detailed mechanisms by which miR-296-3 p functions as a tumor suppressor to prevent lung adenocarcinoma(LADC) cell growth, metastasis, and chemoresistance. Experimental Design: The miR-296-3 p expression was examined by real-time PCR and in situ hybridization. MTT, EDU incorporation, Transwell assays, and MTT cytotoxicity were respectively performed for cell proliferation, metastasis, and chemoresistance, western blotting was performed to analyze the pathways by miR-296-3 p and HDGF/ddx5 complex. The mi RNA microarray and luciferase reporter assays were respectively used for the HDGF-mediated miRNAs and target genes of miR-296-3 p. The ChIP, EMSA assays,and Co-immunoprecipitation combined with mass spectrometry and GST pull-down were respectively designed to analyze the DNA-protein complex and HDGF/ddx5/β-catenin complex. Results: We observed that miR-296-3 p not only controls cell proliferation and metastasis, but also sensitizes LADC cells to Cisplatin(DDP) in vitro and in vivo. Mechanistic studies demonstrated that miR-296-3 p directly targets PRKCA to suppress FAK-Ras-c-Myc signaling thus stimulating its own expression in a feedback loop that blocks cell cycle and epithelial-mesenchymal transition(EMT) signal. Furthermore, we observed that suppression of HDGF-β-catenin-c-Myc signaling activates miR-296-3 p, ultimately inhibiting the PRKCA-FAK-Ras pathway. Finally, we found that ddx5 directly interacts with HDGF and induces β-catenin-c-Myc, which suppresses miR-296-3 p and further activates PRKCA-FAK-Ras, cell cycle, and EMT signaling. In clinical samples, reduced miR-296-3 p is an unfavorable factor that inversely correlates with HDGF/ddx5, but not PRKCA. Conclusions: Our study provides a novel mechanism that the miR-296-3 p-PRKCA-FAK-Ras-c-Myc feedback loop modulated by HDGF/ddx5/β-catenin complex attenuates cell growth, metastasis, and chemoresistance in LADC.

关键词： miR-296-3p LADC PRKCA HDGF ddx5

来源： cnki会议评论

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ddx5在甲状腺癌中的表达及其临床意义

中华临床医师杂志（电子版） 2023年第4期17卷 386-390页

作者：赵雪琴苏学峰任东伟崔冰冰王振东李慧临汾市人民医院病理科山西临汾041000 临汾市人民医院院办山西临汾041000 临汾市人民医院甲乳科山西临汾041000 临汾市人民医院临床研究中心山西临汾041000 临汾市人民医院胸外科山西临汾041000 临汾市人民医院智慧医院办公室山西临汾041000

目的探讨DEAD-box家族的ddx5(RNA解旋酶)在甲状腺癌组织中的表达,并分析其临床病理意义。方法收集临汾市医联体范围内2014年10月~2021年9月手术治疗切除的甲状腺癌组织标本100例,甲状腺良性病变组织标本100例,并收集患者临床病理学资料... 详细信息

目的探讨DEAD-box家族的ddx5(RNA解旋酶)在甲状腺癌组织中的表达,并分析其临床病理意义。方法收集临汾市医联体范围内2014年10月~2021年9月手术治疗切除的甲状腺癌组织标本100例,甲状腺良性病变组织标本100例,并收集患者临床病理学资料;采用免疫组化法与Western blot法检测甲状腺癌及良性病变组织中ddx5的表达情况,并对检测结果进行统计学分析。结果甲状腺癌组织中ddx5/β-actin蛋白表达情况显著高于良性组织(30.44±3.71 vs 13.22±2.83,Pddx5阳性表达与淋巴结转移、甲状腺癌临床分期显著相关(P5),与甲状腺癌患者的年龄、性别、病理类型无相关性(P>0.05)。结论ddx5过表达参与了甲状腺癌的发生与发展。

关键词：甲状腺癌良性病变 ddx5

ddx5对白血病K562细胞生物学功能的影响及其机制

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安徽医科大学学报 2024年第9期59卷 1557-1563页

作者：胡爽陈晓冉冯钰斌安徽医科大学药学院合肥230032 安徽中医药大学药学院合肥230013 中国科学技术大学附属第一医院(安徽省立医院)药学部、精准药物制剂与临床药学安徽省重点实验室合肥230001

目的探讨ddx5解螺旋酶对白血病细胞系K562细胞增殖、凋亡和分化的影响。方法利用癌症基因数据库GEPIA中的数据分析ddx5 mRNA在白血病患者组织中的表达;生存曲线分析ddx5 mRNA表达水平与白血病患者预后关系;采用小干扰RNA(siRNA)瞬时转染... 详细信息

目的探讨ddx5解螺旋酶对白血病细胞系K562细胞增殖、凋亡和分化的影响。方法利用癌症基因数据库GEPIA中的数据分析ddx5 mRNA在白血病患者组织中的表达;生存曲线分析ddx5 mRNA表达水平与白血病患者预后关系;采用小干扰RNA(siRNA)瞬时转染K562细胞以敲低ddx5;使用实时荧光定量(RT-PCR)检测沉默效果;采用Western blot检测蛋白表达水平;采用CCK-8实验检查细胞增殖能力、采用Western blot和免疫荧光检测细胞增殖相关蛋白的表达水平;采用流式细胞术检测细胞凋亡;采用流式细胞术和Western blot检测细胞分化相关蛋白的表达水平。最后,通过RT-PCR和Western blot检测沉默ddx5对P21和P53蛋白表达水平的影响。结果GEPIA数据库分析结果显示ddx5在人白血病骨髓组织中的表达水平显著高于健康人群,低表达ddx5的患者具有更长的生存期。体外实验表明敲低ddx5可显著抑制K562细胞的增殖,流式细胞术检测结果表明可以促进细胞凋亡、促进CD11b和CD14蛋白的表达诱导细胞分化。沉默ddx5促进P21和P53蛋白的表达水平。结论ddx5可能通过靶向P53抑制白血病细胞系K562细胞增殖,促进凋亡诱导分化。

关键词： K562细胞 ddx5 细胞增殖凋亡细胞分化 P53

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RNA解螺旋酶ddx5在肿瘤中的研究进展

临床与实验病理学杂志 2017年第4期33卷 428-431页

作者：赵韵丛文铭第二军医大学附属东方肝胆外科医院病理科上海200438

RNA解螺旋酶ddx5(DEAD-box helicase 5)是一种具有多种生物活性功能的核蛋白,在核糖体生物合成、细胞增殖及凋亡等多种生物学过程中发挥重要作用,同时也对多种转录因子具有共激活作用。最新研究发现,ddx5在乳腺癌、前列腺癌、非小细胞... 详细信息

RNA解螺旋酶ddx5(DEAD-box helicase 5)是一种具有多种生物活性功能的核蛋白,在核糖体生物合成、细胞增殖及凋亡等多种生物学过程中发挥重要作用,同时也对多种转录因子具有共激活作用。最新研究发现,ddx5在乳腺癌、前列腺癌、非小细胞肺癌等多种肿瘤组织中表达异常,参与肿瘤生物学行为的调控,是肿瘤诊断及预后的新标志。探索ddx5在肿瘤中的作用机制可能对诊疗及预后均有重要意义。该文就ddx5基因及蛋白的结构和功能,特别是其在肿瘤中的研究进展作一综述,并对其研究前景进行展望。

关键词：肿瘤 ddx5 发病机制文献综述

ddx5在Ⅳ期结直肠癌中的表达及其在预后评价中的作用

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DDX5在Ⅳ期结直肠癌中的表达及其在预后评价中的作用

作者：周露南华大学

学位级别：硕士

目的分析ddx5在Ⅳ期结直肠癌患者癌组织中的表达水平及其与临床特征的相关性,探讨Ⅳ期结直肠癌患者癌组织中ddx5的表达水平及其在预后评价中的作用。方法第一部分纳入邵阳市中心医院2018年09月01日至2021年9月30日期间收治的Ⅳ期结直肠... 详细信息

目的分析ddx5在Ⅳ期结直肠癌患者癌组织中的表达水平及其与临床特征的相关性,探讨Ⅳ期结直肠癌患者癌组织中ddx5的表达水平及其在预后评价中的作用。方法第一部分纳入邵阳市中心医院2018年09月01日至2021年9月30日期间收治的Ⅳ期结直肠癌患者230例。采用免疫组化方法检测Ⅳ期结直肠癌患者癌组织中ddx5蛋白的表达水平,分析ddx5在Ⅳ期结直肠癌患者癌组织中的表达情况及其与临床特征的相关性。第二部分纳入邵阳市中心医院2019年10月01日至2020年11月30日期间收治的Ⅳ期结直肠癌患者118例。依据患者癌组织中ddx5蛋白的表达水平将其分为低表达组及高表达组;根据2019年中国临床肿瘤学会(CSCO)结直肠癌诊疗指南推荐的方案,将其分为化疗组及化疗联合靶向治疗组;参照RECIST 1.1实体瘤评价疗效标准,观察两种治疗方法患者的客观缓解率(objective response rate,ORR)及无进展生存期(progression-free survival,PFS),比较ddx5高、低表达组患者ORR及中位PFS的差异,阐明Ⅳ期结直肠癌患者癌组织中ddx5的表达水平与患者预后的关系。结果第一部分(1)单因素分析显示:Ⅳ期结直肠癌患者癌组织中ddx5蛋白的高表达与其分化程度、Ki-67有关(P5);Ⅳ期结直肠癌患者癌组织中ddx5蛋白的表达与患者的性别、年龄、肿瘤部位、组织学分型、腹腔积液、远处转移情况、错配修复(MMR)蛋白无关(P>0.05)。(2)Kendall相关性分析显示:Ⅳ期结直肠癌患者癌组织中ddx5蛋白的表达水平与Ki-67成正相关(r=0.234,Pddx5蛋白的表达水平与分化程度成正相关(r=0.127,P=0.044)。(3)Logistic回归分析显示:Ki-67是Ⅳ期结直肠癌患者癌组织中ddx5蛋白表达水平的影响因素(P5)。第二部分(1)疗效评价结果:化疗组及化疗联合靶向治疗组的ORR分别为41.90%、62.50%,化疗组疗效较化疗联合靶向治疗组疗效差,两组比较差异有统计学意义(P5)。化疗组中ddx5蛋白高表达组及低表达组的ORR分别为40.40%、44.80%,两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。化疗联合靶向治疗组中ddx5蛋白高表达组及低表达组的ORR分别为63.20%、61.50%,两组比较差异无统计学意义(P>0.05)。(2)单因素分析显示:不同分化程度的患者中位PFS差异有统计学意义(P5)。有腹腔积液患者中位PFS较无腹腔积液者短,差异有统计学意义(P5)。d MMR组患者中位PFS较p MMR者短,差异有统计学意义(P5)。ddx5蛋白高表达患者中位PFS较低表达者短,差异有统计学意义(P5)。而患者的性别、年龄、肿瘤部位、组织学类型、Ki-67及远处转移情况对中位PFS无影响(P>0.05)。(3)Cox风险回归分析显示:低分化患者疾病进展风险是高分化的1.901倍(HR:1.901,95%CI:1.018.551,P5);d MMR患者疾病进展风险是p MMR的2.083倍(HR:2.083,95%CI:1.172.702,P5);ddx5蛋白高表达患者疾病进展风险是低表达的1.623倍(HR:1.623,95%CI:1.025.572,P5)。结论(1)Ⅳ期结直肠癌患者癌组织中ddx5蛋白的表达水平与Ki-67成正相关。(2)ddx5蛋白的高表达是Ⅳ期结直肠癌患者的不良预后因素。

关键词：结直肠癌 ddx5 ORR PFS

猪繁殖与呼吸综合征病毒N蛋白与宿主细胞ddx5蛋白相互作用研究

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中国动物传染病学报 2017年第3期25卷 12-17页

作者：刘欢黄勤锋张文超姜一峰杨莘高飞周艳君童光志中国农业科学院上海兽医研究所上海200241

研究利用免疫共沉淀的方法证明猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)N蛋白与MARC-145细胞ddx5蛋白之间存在相互作用,且两种蛋白共定位于MARC-145细胞质内。利用构建的EGFP-N和m Cherry-ddx5真核表达载体共转染MARC-145细胞后,发现N蛋白并不能将ddx5蛋白募集至细胞质。采用si RNA沉默MARC-145细胞ddx5基因表达之后,病毒复制水平上升;荧光定量检测结果显示,ddx5沉默表达也能够明显促进病毒基因组RNA和长链亚基因组RNA的转录水平。结果表明ddx5参与了病毒复制转录过程并对病毒增殖具有抑制作用。

关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒 N蛋白 ddx5 相互作用

基于CRISPR/Cas9基因编辑系统构建敲除ddx5基因的猪肾细胞系

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中国兽医科学 2021年第10期51卷 1259-1263页

作者：金彩燕吴金恩何童童孙世琪郭慧琛张小丽甘肃农业大学动物医学院甘肃兰州730070 中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室国家口蹄疫参考实验室甘肃兰州730046 长江大学动物科学学院湖北荆州434025

利用CRISPR/Cas9基因编辑系统,建立ddx5基因敲除的PK-15细胞系。使用E-CRISPR在线设计网站分别对猪ddx5第1外显子和第2外显子设计sgRNA,以质粒pSpCas9(BB)-2A-Puro(pX459)为载体,将退火后的sgRNA连接到线性化载体pX459上,得到敲除载体pX... 详细信息

利用CRISPR/Cas9基因编辑系统,建立ddx5基因敲除的PK-15细胞系。使用E-CRISPR在线设计网站分别对猪ddx5第1外显子和第2外显子设计sgRNA,以质粒pSpCas9(BB)-2A-Puro(pX459)为载体,将退火后的sgRNA连接到线性化载体pX459上,得到敲除载体pX459-sgRNA-ddx5。以脂质体Lipofectamine2000转染pX459-sgRNA-ddx5至PK-15细胞,经嘌呤霉素压力筛选得到单克隆细胞,通过扩增基因组ddx5序列进行测序和Western-blot鉴定筛选细胞系中ddx5敲除效果。DNA测序结果表明:sgRNA被成功插入载体pX459,并在靶向基因编辑位点产生移码突变;经Western-blot验证,敲除细胞系中ddx5蛋白基本不表达。上述结果表明,本研究采用CRISPR/Cas9技术成功构建了敲除ddx5基因的PK-15细胞系。

关键词： ddx5 敲除 CRISPR/Cas9

ddx5和ddx17对干细胞及重编程的作用机制研究

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Ddx5和Ddx17对干细胞及重编程的作用机制研究

作者：郭菲菲大连医科大学

学位级别：硕士

实验目的:1.研究ddx5和ddx17在胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ES cell)、诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell,i PS cell)中的作用。2.探究ddx5和ddx17在干细胞及重编程中对下游基因的选择性剪接作用。实验方法:为了研究ddx... 详细信息

实验目的:1.研究ddx5和ddx17在胚胎干细胞(Embryonic stem cell,ES cell)、诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell,i PS cell)中的作用。2.探究ddx5和ddx17在干细胞及重编程中对下游基因的选择性剪接作用。实验方法:为了研究ddx5和ddx17在ES及i PS中的作用,首先检测了二者在ES、MEF(mouse embryonic fibroblasts,小鼠胚胎成纤维细胞)中的表达,及构建了带MKO红色荧光的真核表达载体。用此载体建立受Dox(强力霉素)控制的Tet-on调控系统的过表达ES稳转细胞株,并利用PCR、q PCR技术在基因组水平和RNA水平进行检测,同时构建了敲低的载体及用此载体建立了敲低的ES稳转细胞株。利用q PCR方法检测在ES中过表达和敲低ddx5以及过表达ddx17对多能性基因表达的影响。另外,用q PCR检测在无LIF(Leukemia Inhibitory Factor,白血病抑制因子)培养的ES分化过程中,ddx5和ddx17的基因表达变化。及在过表达、敲低ddx5和过表达ddx17,在无LIF培养条件下进行ES分化,检测对Nanog、Oct4等多能性基因及与胚胎发育相关的三个胚层的基因Fgf5、T、Gata6的表达变化。利用构建成功的二次重编程系统小鼠制备MEF。利用MEF细胞在含有Dox的ES培养基中诱导重编程,并用q PCR技术检测在重编程过程中ddx5和ddx17的基因表达变化及用流式细胞术和碱性磷酸酶染色检测它们对重编程效率的影响。由于ddx5、ddx17的这些不同作用,之后研究了ddx5和ddx17对下游基因在干细胞和重编程中的选择性剪接作用。在已发表的文献数据库中查找了大量相关基因,设计引物,收取2天的样品,提RNA进行RT-PCR检测,分析二者对候选基因的选择性剪接变化。对有明显选择性变化的基因进行下一步研究。针对有选择性剪接变化的基因各自的亚型,分别构建真核表达载体,检测其在ES、MEF中的表达及重编程过程中的基因表达变化。研究不同亚型在重编程过程中有什么作用。实验结果:1、真核表达载体及ES稳转细胞株构建成功。1)ddx5过表达、敲低的真核表达载体及相应的ES稳转细胞株构建成功。2)ddx17过表达的真核表达载体及ES稳转细胞株构建成功。2、ddx5和ddx17在ES中发挥着重要作用。1)与MEF细胞相比,ddx5在ES中表达高,ddx17在ES中表达较低。2)过表达ddx5后,多能性基因表达上调;敲低则相反。过表达ddx17后,多能性基因表达上调。3)在无LIF培养的ES分化过程中,ddx5和ddx17的表达下降,呈递减模式。3、ddx5和ddx17在重编程中发挥着重要作用。1)在重编程过程中ddx5、ddx17的表达明显上升,呈递增模式。2)过表达ddx5后可促进重编程效率,敲低则明显降低。3)过表达ddx17后可降低重编程效率。4、在ES中,过表达ddx5后对Hras、CD44等有选择性剪接作用;在重编程中对H-ras等有选择性剪接作用。5、在ES、重编程中ddx5和ddx17对Hras的选择性剪接作用不同。1)在ES及重编程中发现,过表达ddx5对Hras有选择性剪接作用,可使亚型2的表达上调,亚型1的表达下调。而ddx17对Hras无选择性剪接作用。2)在普通MEF(129-rt TA-MEF)中,ddx5和ddx17对Hras的选择性剪接变化不明显。6、Hras亚型1的真核表达载体构建成功;Hras总体RNA水平在ES、MEF中的表达变化差异不大;在重编程过程中亚型1的表达逐渐明显上升,呈递增模式。并且Hras总体RNA水平在重编程过程中表达上调。实验结论:ddx5和ddx17在ES和重编程过程中都发挥着作用,但是有所不同,它们对下游基因Hras的选择性剪接作用不同。

关键词： ES 重编程 ddx5 ddx17 选择性剪接

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ddx5蛋白抑制宿主先天性免疫的初步研究

DDX5蛋白抑制宿主先天性免疫的初步研究

作者：马振邦江西农业大学

学位级别：硕士

宿主细胞DEAD-box(ddx)家族蛋白是一种结构高度保守且数量众多的RNA解旋酶,主要参与宿主细胞基因的转录调控。然而,近年来的研究表明,ddx家族蛋白还参与宿主的先天性免疫反应,在I型干扰素(IFN-I)的产生及炎症反应方面发挥重要作用。ddx... 详细信息

宿主细胞DEAD-box(ddx)家族蛋白是一种结构高度保守且数量众多的RNA解旋酶,主要参与宿主细胞基因的转录调控。然而,近年来的研究表明,ddx家族蛋白还参与宿主的先天性免疫反应,在I型干扰素(IFN-I)的产生及炎症反应方面发挥重要作用。ddx5蛋白是ddx家族的重要成员,其不仅在细胞生长发育及肿瘤发生发展中发挥作用,而且在多种病毒的感染过程中影响病毒的复制。然而其作用机制尚不清楚,我们在前期研究中发现,MDV可以调控宿主ddx5蛋白来抑制宿主先天性免疫反应,并促进病毒在鸡胚成纤维细胞上的生长,这表明ddx5在禽类先天性免疫过程中发挥重要作用。然而,ddx5是否在哺乳动物先天性免疫过程中发挥同样的作用尚未见报道。为了进一步证实ddx5蛋白调控哺乳动物的先天性免疫反应。本研究采用水疱性口炎病毒(VSV)分别感染ddx5基因敲降或过表达的小鼠成纤维细胞,通过测定病毒诱导的IFN-β和IL-6 m RNA转录水平、细胞上清IFN-β和IL-6的含量及对病毒复制的影响,结果发现ddx5显著性抑制病毒感染后IFN-β和IL-6的产生并增强病毒的复制,研究表明ddx5在先天性免疫中作为一个负抗病毒调节因子来抑制病毒感染后IFN-β和IL-6的产生并且促进病毒的复制;采用CRISPR/Cas9技术构建ddx5基因缺失小鼠,对其后代与野生型后代小鼠使用VSV与仙台病毒(Se V)进行攻毒实验,通过ELISA测定比较两种不同小鼠巨噬细胞培养上清和血清中IFN-β和IL-6的分泌量,并测定小鼠体内器官(肺、肝、脾)中病毒的复制滴度,同时进行组织病理学分析,结果显示病毒感染后,ddx5小鼠相对于野生型子代小鼠,血清中IFN-β和IL-6的产量显著增加,并且ddx5小鼠的肺间质性肺炎较少,肝脏损伤较轻,脾脏病变较少,研究表明ddx5蛋白在小鼠体内通过负调控先天性免疫,促进病毒复制并加强了病毒导致的组织损伤;为进一步探索作用机制,通过Pull down和Co-IP实验筛选鉴定出与ddx5相互作用的宿主蛋白靶蛋白METTL3,通过分析ddx5/METTL3的结构域,分别构建ddx5截短体和METTL3截短体鉴定蛋白相互作用的功能域,结果发现ddx5与METTL3之间的分子相互作用需要有METTL3的N端结构域和ddx5的P68HR结构域,研究证实ddx5通过其P68HR区域和METTL3的N端相互作用。综上所述,我们首次证明ddx5蛋白在哺乳动物细胞内负调控IFN-β和IL-6的产生,其通过P68HR结构域与宿主细胞METTL3蛋白的N端区域相互作用。研究结果不仅为ddx5在病毒感染先天性免疫过程中的作用机制的研究提供基础,也为新型的抗病毒药物研发提供潜在靶点。

关键词：先天性免疫 DEAD-box解旋酶 ddx5 METTL3 IFN-β