黄藤总生物碱抗抑郁作用及作用机制研究

作     者：于贺 

作者单位：吉林农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：何忠梅

授予年度：2021年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：黄藤总生物碱 抑郁症 HT22细胞 CUMS模型小鼠 作用机制 

摘      要：抑郁症是危及健康的神经损伤性精神疾病,临床表现为学习记忆能力下降、对事物失去兴趣等,严重者会引发自杀的行为。世卫组织(WTO)将严重抑郁症列为全球疾病负担的第三大原因,据WTO预测,到2030年抑郁症将成为全球最大的疾病负担。目前,临床上现存可治疗抑郁症的药物由于作用机制不同,在药效上存在极大差异,只能起到缓解作用,还存在作用靶点单一,不良反应较多的的缺点。因此,从中药资源中开发具有“多途径多靶点、“副作用少的天然药物新药已成为新药研发的趋势和国内外科学家的研究重点。黄藤为防己科天仙藤属植物黄藤(Fibraurea recisa Pierre.)的干燥藤茎,其主要药效活性成分为黄藤总生物碱,具有抗炎、神经保护、抗老年痴呆、增强免疫力等多种药理活性,但是,黄藤总生物碱治疗抑郁症的作用机制如何尚未见报道。因此,本研究基于细胞水平、动物水平联合网络药理学,从“三层次阐明黄藤总生物碱的抗抑郁作用及作用机制,为黄藤总生物碱的进一步开发利用提供科学依据。1.本研究将采用体外CORT诱导的HT22细胞损伤试验和慢性不可预见性应激(CUMS)刺激小鼠建立抑郁模型,通过CCK-8法、行为学检测、ELISA等技术分析黄藤总生物碱的抗抑郁作用。细胞试验结果表明,黄藤总生物碱对皮质酮诱导的HT22细胞损伤具有改善作用,并呈剂量依赖性,当黄藤总生物碱浓度为0.05 mg/m L时,作用效果最好;动物试验结果表明,黄藤总生物碱可显著改善CUMS小鼠的抑郁样行为,减少快感消失等现象的发生,并能提高了血清中5-HT、DA及NE的含量,说明黄藤总生物碱具有抗抑郁的效果。2.运用网络药理学分析了黄藤总生物碱治疗抑郁症的作用靶点,PPI网络图及药物-靶点-通路网络图,筛选获得AKT1、MAPK1、GSK3β、PI3K等基因作为核心靶点,推测黄藤总生物碱中神经营养信号通路、Erb B、PI3K-Akt、VEGF、MAPK等信号通路在神经保护、免疫调节、细胞凋亡等方面起作用,从而对抑郁症产生治疗的效果,为后续作用机制的深入研究提供依据。3.通过以上条件建立的体外HT22细胞损伤模型及体内小鼠CUMS模型试验,利用荧光显微镜观察细胞形态变化情况,利用Western blot分析细胞和小鼠海马内Bcl-2、Bax及cleaved Caspase-3等凋亡相关蛋白表达情况。结果显示,CORT诱导的细胞模型组,出现大量的蓝色亮点,荧光强度增强,而使用黄藤总生物碱进行预保护的组别,蓝色亮点显著减少,荧光强度减弱,改善了CORT造成的细胞损伤情况。且黄藤总生物碱可增加HT22细胞和小鼠海马中Bcl-2蛋白的表达,降低Bax及cleaved Caspase-3蛋白含量,说明黄藤总生物碱可能通过抗凋亡途径减轻神经细胞损伤而起到抗抑郁作用。4.从网络药理学预测的通路中选择BDNF-MEK/ERK-CREB经典神经信号通路,验证黄藤总生物碱的抗抑郁作用。基于以上试验条件建立的体外细胞模型和体内动物模型,通过行为学评价、ELISA及Western blot等方法从多方面探讨黄藤总生物碱的抗抑郁作用机制。结果表明,在细胞试验中,黄藤总生物碱通过增加损伤后HT22细胞的细胞活力及BDNF含量,上调BDNF、ERK、CREB等关键蛋白的表达水平发挥抗抑郁作用,但MEK抑制剂AZD6244可部分阻断抗性效果。动物试验中,黄藤总生物碱可改善CUMS模型小鼠的体重下降,糖水偏爱程度降低,不动时间延长等现象,还可增加小鼠血清的BDNF含量,上调BDNF、ERK、CREB等关键蛋白的表达,而加入MEK抑制剂后,表达下降,说明黄藤总生物碱发挥抗抑郁作用可能与BDNF-MEK/ERK-CREB神经信号通路有关。5.采用CORT诱导HT22细胞损伤和CUMS动物抑郁模型,给予黄藤总生物碱和NLRP3炎症小体抑制剂BAY11-7082治疗干预,通过行为学检测、ELISA及Western blot等方法,从NLRP3/Caspase-1炎症通路探讨黄藤总生物碱的神经保护机制。结果显示,在细胞试验中,黄藤总生物碱及NLRP3炎症小体抑制剂BAY11-7082都可显著降低细胞活力及IL-1β、IL-6、TNF-α等炎症因子水平,对NLRP3、ASC及Caspase-1等关键蛋白具有抑制效果。动物试验中,黄藤总生物碱及抑制剂可缓解CUMS小鼠抑郁状况,显著降低炎症因子水平,抑制NLRP3、ASC及Caspase-1蛋白表达,说明黄藤总生物碱抗抑郁作用机制可能与抑制NLRP3/Caspase-1神经炎症通路中关键因子有关。