血液样本处理对RNA测序数据影响的研究

作     者：欧阳汀兰 

作者单位：东南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：葛芹玉

授予年度：2020年

学科分类：100208[医学-临床检验诊断学] 1002[医学-临床医学] 10[医学] 

主      题：RNA-seq 二代测序 样本处理 储存时间 离心速度 批次效应 

摘      要：人类基因组计划顺利实施及后续的影响使高通量测序技术得到了空前的发展,然而其面临的问题也日益凸显。高通量测序数据标准不统一,数据质量也因各技术环节的影响而参差不齐,其中较为繁琐的最繁琐的样本准备过程带来的影响最为复杂,这一问题目前已经得到了大家的普遍重视和日益关注。临床检测已经成为高通量测序技术应用发展的主要方向,明确影响测序数据质量的因素具有深远的意义。本论文以血液这一最为常用的临床样本为研究对象,重点研究了血液储存时间以及外周血单核细胞(PBMC)样本分离方法对其RNA测序数据质量的研究,对测序数据质量及准确度进行了探索分析,在差异表达基因分析的基础上找到了一些规律性变化且与储存时间相关的基因。该研究能够拓展高通量测序在临床相关研究中的应用,促进其进一步发展。论文的主要研究内容如下:1)在PBMC样本研究中,通过比较不同样品处理间的基因表达差异,发现随着贮藏时间的延长,差异逐渐扩大,而对总基因的影响不显著。在PBMC测序数据中发现了5个随时间呈梯度差异的基因,它们都是免疫相关基因,这些基因在以前的研究中没有提及,这提示我们按照常规的生物标记分子筛选方法而不注重样本处理无疑会产生偏差。此外,离心速度的影响大于保存时间,不同的离心速度可诱导差异表达。本文还分析了不同的贮存时间和离心速度对相同样品的影响,为血液保存时期如何操作和处理样本提供了理论依据。2)在全血样本研究中,通过比较相同样品不同储存时间的基因表达差异,发现24小时之内的基因表达差异不明显。甚至于,人群差异大于储存时间影响。然而,全血与PBMC的测序结果表明,大部分差异基因与红细胞功能相关,这很有可能是血红蛋白的权重太大造成的背景干扰。因此,全血试剂盒提取RNA替代传统PBMC提取虽然操作简便,但血红蛋白基因相关的背景干扰影响了结果。