龙脷叶质量控制及其总黄酮提取纯化和抗氧化活性研究

作     者：陈素雯 

作者单位：广东药科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李苑新;吴燕红

授予年度：2021年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：龙脷叶 质量控制 总黄酮 提取纯化 抗氧化活性 

摘      要：目的:建立不同采收期龙脷叶的HPLC指纹图谱,结合化学模式识别评价质量差异并通过UPLC-Q-TOF-MS技术鉴定化学成分;并建立龙脷叶总黄酮含量测定方法,对其总黄酮进行提取纯化,对纯化产物开展化学成分鉴定研究和抗氧化活性研究。实验结果将为龙脷叶质量控制及其黄酮类成分的开发应用提供科学依据。方法:(1)通过HPLC法建立不同采收期龙脷叶的HPLC指纹图谱,结合化学模式识别开展聚类分析、主成分分析和正交偏最小二乘法判别分析的数据挖掘,筛选出不同采收期龙脷叶间的质量标志物;通过UPLC-Q-TOF-MS技术鉴定龙脷叶中的化合物。(2)以芦丁为对照品,总黄酮提取得率为指标,建立龙脷叶总黄酮含量测定方法;通过单因素试验确定龙脷叶总黄酮的提取条件。通过大孔树脂静态、动态吸附解吸试验比较不同型号的树脂(D101、AB-8、HPD100、HPD600、DM301、NKA9)对龙脷叶总黄酮的纯化效果,筛选树脂型号;通过单因素试验筛选上样液的浓度、p H、体积,乙醇洗脱液的体积分数、洗脱用量等纯化参数;结合吸附动力学模型和吸附等温模型拟合分析大孔树脂吸附机制。采用HPLC法和UPLC-Q-TOF-MS法分析鉴定纯化产物的化学成分。(3)以抗坏血酸(VC)为对照,采用总抗氧化能力、清除DPPH自由基、OH自由基和ABTS自由基的能力来评价龙脷叶总黄酮的体外抗氧化活性。结果:(1)从各个采收期龙脷叶的HPLC指纹图谱中标定出21个共有峰,且相似度均超过0.9,但共有峰相对峰面积的RSD值大多高于20%,说明11批药材的整体质量相对稳定,具有良好的相似度但含量差异明显;龙脷叶化学成分含量在夏秋两季较大,此时采收最佳。HCA将11批龙脷叶分为3大类,PCA提取出4个主成分PC1、PC2、PC3和PC4,累积贡献率达94.446%,OPLS-DA筛选出药材间呈现差异的9个质量标志物。经UPLC-Q-TOF-MS技术共鉴定出47个化学成分。(2)龙脷叶总黄酮的提取工艺如下:加50倍量水,水浴回流提取两次,第一次90 min,第二次60 min,滤过,收集滤液,浓缩至生药浓度1 g/m L备用。龙脷叶总黄酮在AB-8树脂中有较优的纯化效果,总黄酮的吸附动力学行为与准二级动力学模型相符(R=0.9988),等温吸附曲线与Freundlich模型相符(R=0.9839)。最佳纯化工艺参数为:取1.5 BV浓度为0.167 mg/m L、p H=5的上样溶液,以1 m L/min的流速上柱,充分吸附后用4 BV纯净水洗去杂质后,用4 BV 50%乙醇溶液以2 m L/min的流速洗脱;总黄酮保留率为98.42%,纯度为22.17%,较纯化前提高了3.06倍。经UPLC-Q-TOF-MS分析鉴定纯化产物中可能含有槲皮素-3-O-龙胆二糖苷、山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖-β-D-葡萄糖-β-D-葡萄糖苷、山奈酚-3-O-龙胆二糖苷等黄酮成分。同时,可能还含有蛋氨酸、(-)-南烛木树脂酚-3α-O-β-D-葡萄糖苷、阿魏酸、二丁基-2,2-二甲基丙二酸酯和4H-1-Benzopyran-4-one等。(3)龙脷叶总黄酮总抗氧化活性及清除DPPH自由基、OH自由基和ABTS自由基的能力与浓度均呈正相关。相同反应时间下,龙脷叶总黄酮总氧化活性明显强于VC;总黄酮和VC对DPPH·的清除率IC分别为74μg/m L、85μg/m L,对OH·的清除率IC分别为376.38μg/m L、262μg/m L,对ABTS的清除率IC分别为10.94μg/m L、11.70μg/m L。结论:建立了不同采收期龙脷叶的HPLC指纹图谱,基于指纹图谱结合化学模式识别评价不同采收期龙脷叶的质量差异,构建更为完善、有效合理的龙脷叶质量评价方法。建立的龙脷叶总黄酮提取纯化工艺稳定可靠,能有效提高总黄酮纯度,为其成分分析和活性研究奠定基础。龙脷叶总黄酮具有较强的体外抗氧化活性且与浓度存在一定的量效关系,具有临床开发意义。