新型细胞穿膜肽P2穿膜特性的生物信息学分析及介导HaloTag蛋白胞内递送定位的实验研究

作     者：郭向丽 

作者单位：三峡大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王琥;柳长柏

授予年度：2021年

学科分类：0831[工学-生物医学工程（可授工学、理学、医学学位）] 0710[理学-生物学] 0711[理学-系统科学] 07[理学] 08[工学] 071009[理学-细胞生物学] 09[农学] 0901[农学-作物学] 090102[农学-作物遗传育种] 

主      题：细胞穿膜肽 P2 蛋白递送 HaloTag 

摘      要：研究背景:细胞穿膜肽(Cell Penetrateing Peptide,CPP)是一类能够携带蛋白及其他生物大分子入胞的非病毒基因载体。目的:本实验旨在研究新型细胞穿膜肽P2穿膜效率及其作为载体介导自标记标签蛋白—HaloTag蛋白入胞效率和递送定位,为更深一步应用P2这一新型细胞穿膜肽作为生物大分子运输载体在胞内的递送定位提供理论支持。方法:(1)通过生物信息学方法及结合已报道的CPPs结构特征,设计并合成出带有荧光素标签的P2-FITC、NCO-FITC等短肽,预测和检测其理化性质、结构特征和穿膜活性等。(2)将P2、NCO与细胞体外一起孵育,荧光显微镜定性观察胞内的绿色荧光分布,以及结合荧光酶标仪、全波长酶标仪量化胞内的荧光强度,分析在时间、浓度以及不同细胞系或同其他CPPs比较等条件下P2进入细胞的荧光量变化。(3)在温度梯度及不同抑制剂孵育条件下,分别定性和定量检测P2穿膜效率受到的影响,并结合生物信息学预测肽与膜之间相互作用进一步初步判断和分析P2可能的穿膜机制。(4)通过MTT实验检测P2对细胞增殖的影响,溶血实验、乳酸脱氢酶(LDH)释放实验分析P2对细胞的磷脂双层膜完整性的影响等进一步检测P2对细胞是否具有毒性影响。(5)构建原核表达质粒p ET15b-HaloTag-P2、p ET15b-HaloTag-Dot1l、p ET15b-HaloTag并诱导表达和纯化出融合蛋白HaloTag-P2、HaloTag-Dot1l、HaloTag,分别与细胞孵育后加入HaloTag配基—TMR继续孵育后固定,单独的TMR作空白对照,通过Bio Tek成像系统定性观察融合蛋白HaloTag-P2、HaloTag-Dot1l、HaloTag在胞内递送的示踪定位,用Image J软件定量分析融合蛋白在胞内的递送效率及阳性细胞所占细胞数量比。结果:(1)应用生物信息学方法对P2理化性质、结构及穿膜效率进行了较为准确的预测。(2)低浓度至高浓度的P2均穿透细胞膜,荧光强度与浓度呈正相关;P2穿膜效率在短时间内,荧光量随着时间延长累积增多;P2的穿膜作用没有细胞选择特异性,5%DMSO可以明显提高P2的穿膜效率。(3)低温对P2的穿膜效率略有影响;血清、肝素、EIPA、Chlorpromazine的存在可以抑制P2的穿膜效率,内吞抑制剂Na N、NHCl、MβCD、wortmannin、高渗蔗糖对P2的穿膜效率的抑制不显著。(4)P2的穿膜作用对细胞无明显毒性影响。(5)P2可以介导蛋白大分子物质如HaloTag蛋白递送入胞并主要分布于细胞核。结论:(1)P2是具有较高穿膜效率的新一类细胞穿膜肽;(2)P2的穿膜机制可能是通过内吞途径;(3)P2没有明显的细胞毒性;(4)P2能够介导HaloTag蛋白胞内递送;(5)HaloTag-P2作为新型探针主要定位于胞核,少量定位在胞浆。