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halotag多功能标记系统及其在生物学中的应用

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电子显微学报 2014年第2期33卷 147-155页

作者：王锋高婧王宏达中国科学院长春应用化学研究所吉林长春130022

单一载体,即可实现多种实验目的的halotag多功能标记系统在生物学中有着广泛的应用。本文首先介绍了halotag多功能标记系统的组成、反应机制和改造过程,并简要概括了halotag配基的类型。根据halotag配基功能的差异,对其应用分为三个方... 详细信息

单一载体,即可实现多种实验目的的halotag多功能标记系统在生物学中有着广泛的应用。本文首先介绍了halotag多功能标记系统的组成、反应机制和改造过程,并简要概括了halotag配基的类型。根据halotag配基功能的差异,对其应用分为三个方面进行介绍:(1)不同的halotag荧光配基可以实现在亚细胞水平的时空特异成像、单分子水平上的超分辨率显微成像以及在组织水平上对小动物进行活体成像。(2)halotag固相配基可以用于蛋白纯化、蛋白-蛋白以及蛋白-DNA相互作用检测等,具有比其它蛋白标签更加优异的效果。(3)借助疏水性的halotag配基能够诱导目的蛋白的降解。应用该技术,不仅能提高工作效率,还有助于对多个实验结果进行关联分析,在活细胞尤其哺乳动物细胞中有着极好的应用前景。

关键词： halotag halotag配基蛋白纯化降解成像

halotag蛋白靶向一氧化氮荧光探针的合成研究

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HaloTag蛋白靶向一氧化氮荧光探针的合成研究

作者：王超华东理工大学

学位级别：硕士

一氧化氮（NO）是一种重要的生物信号分子,它与生物体内的多种生理和病理机制密切相关。荧光成像法是研究NO的一种有效方法,但是,普通弥散性分布的探针只能检测NO的空间整体平均分布水平。为助于研究一氧化氮在细胞内外的生物学与化学功... 详细信息

一氧化氮（NO）是一种重要的生物信号分子,它与生物体内的多种生理和病理机制密切相关。荧光成像法是研究NO的一种有效方法,但是,普通弥散性分布的探针只能检测NO的空间整体平均分布水平。为助于研究一氧化氮在细胞内外的生物学与化学功能,理想的一氧化氮荧光探针可以用于检测局部、亚细胞结构NO分布水平的改变。而halotag等蛋白质标记技术为解决这一问题提供了有效方法。本文介绍了一种新型的halotag蛋白靶向的荧光探针用于局部NO的检测与成像。本文首先制备了用于halotag蛋白标记的连接子2-（2-（6-氯己氧基）乙氧基）乙胺,并改进其提纯方法。然后合成了6-羧基荧光素用于与反应连接子结合制备用作细胞内蛋白质标记的羧基荧光素二乙酸酯（diAcFAM）配体。使用溴乙酰溴合成了N-（2-（2-（6-氯己氧基）乙氧基））乙基-2-溴乙酰胺,它可以用于含氨基的功能报告基团的halotag连接子。同时合成了NO荧光探针5,6-二氨基荧光素（DAF-2）及其二乙酸酯（DAF-2DA）,N-（2-（2-（6-氯己氧基）乙氧基））乙基-2-溴乙酰胺与DAF-2DA之间的取代反应条件为室温下以DAF为溶剂、碘化钠为催化剂、碳酸钾为碱,产物混合物经LC-MS分析确认目标产物,并使用制备HPLC分离得到halotag-DAF-2DA配体。其二乙酸酯基团可以在渗透进入细胞后被酯酶水解,生成的halotag-DAF-2可被预先基因编码的halotag蛋白固定,并用于亚细胞结构NO水平的检测。由halotag-DAF-2生成halotag-DAF-2T后荧光强度增大约85倍。化合物经1HNMR、13CNMR、HRMS、紫外可见光谱、荧光光谱等手段表征。

关键词：一氧化氮荧光探针二氨基荧光素 halotag

新型细胞穿膜肽P2穿膜特性的生物信息学分析及介导halotag蛋白胞内递送定位的实验研究

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新型细胞穿膜肽P2穿膜特性的生物信息学分析及介导HaloTag蛋白胞...

作者：郭向丽三峡大学

学位级别：硕士

研究背景:细胞穿膜肽(Cell Penetrateing Peptide,CPP)是一类能够携带蛋白及其他生物大分子入胞的非病毒基因载体。目的:本实验旨在研究新型细胞穿膜肽P2穿膜效率及其作为载体介导自标记标签蛋白—halotag蛋白入胞效率和递送定位,为更... 详细信息

研究背景:细胞穿膜肽(Cell Penetrateing Peptide,CPP)是一类能够携带蛋白及其他生物大分子入胞的非病毒基因载体。目的:本实验旨在研究新型细胞穿膜肽P2穿膜效率及其作为载体介导自标记标签蛋白—halotag蛋白入胞效率和递送定位,为更深一步应用P2这一新型细胞穿膜肽作为生物大分子运输载体在胞内的递送定位提供理论支持。方法:(1)通过生物信息学方法及结合已报道的CPPs结构特征,设计并合成出带有荧光素标签的P2-FITC、NCO-FITC等短肽,预测和检测其理化性质、结构特征和穿膜活性等。(2)将P2、NCO与细胞体外一起孵育,荧光显微镜定性观察胞内的绿色荧光分布,以及结合荧光酶标仪、全波长酶标仪量化胞内的荧光强度,分析在时间、浓度以及不同细胞系或同其他CPPs比较等条件下P2进入细胞的荧光量变化。(3)在温度梯度及不同抑制剂孵育条件下,分别定性和定量检测P2穿膜效率受到的影响,并结合生物信息学预测肽与膜之间相互作用进一步初步判断和分析P2可能的穿膜机制。(4)通过MTT实验检测P2对细胞增殖的影响,溶血实验、乳酸脱氢酶(LDH)释放实验分析P2对细胞的磷脂双层膜完整性的影响等进一步检测P2对细胞是否具有毒性影响。(5)构建原核表达质粒p ET15b-halotag-P2、p ET15b-halotag-Dot1l、p ET15b-halotag并诱导表达和纯化出融合蛋白halotag-P2、halotag-Dot1l、halotag,分别与细胞孵育后加入halotag配基—TMR继续孵育后固定,单独的TMR作空白对照,通过Bio Tek成像系统定性观察融合蛋白halotag-P2、halotag-Dot1l、halotag在胞内递送的示踪定位,用Image J软件定量分析融合蛋白在胞内的递送效率及阳性细胞所占细胞数量比。结果:(1)应用生物信息学方法对P2理化性质、结构及穿膜效率进行了较为准确的预测。(2)低浓度至高浓度的P2均穿透细胞膜,荧光强度与浓度呈正相关;P2穿膜效率在短时间内,荧光量随着时间延长累积增多;P2的穿膜作用没有细胞选择特异性,5%DMSO可以明显提高P2的穿膜效率。(3)低温对P2的穿膜效率略有影响;血清、肝素、EIPA、Chlorpromazine的存在可以抑制P2的穿膜效率,内吞抑制剂Na N、NHCl、MβCD、wortmannin、高渗蔗糖对P2的穿膜效率的抑制不显著。(4)P2的穿膜作用对细胞无明显毒性影响。(5)P2可以介导蛋白大分子物质如halotag蛋白递送入胞并主要分布于细胞核。结论:(1)P2是具有较高穿膜效率的新一类细胞穿膜肽;(2)P2的穿膜机制可能是通过内吞途径;(3)P2没有明显的细胞毒性;(4)P2能够介导halotag蛋白胞内递送;(5)halotag-P2作为新型探针主要定位于胞核,少量定位在胞浆。

关键词：细胞穿膜肽 P2 蛋白递送 halotag

halotag技术在α-突触核蛋白质的细胞影像与定量分析中的应用

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首都医科大学学报 2014年第3期35卷 324-330页

作者：冯雪婷张晨光张敏岳志霞邢天禹李慎涛丁卫首都医科大学基础医学院免疫学系北京100069 首都医科大学基础医学院医学遗传学系北京100069

目的探讨halotag技术用于α-突触核蛋白质(α-synuclein,SNCA)在细胞内荧光成像及半定量分析的方法及其应用。方法采用重组克隆技术构建pHalo-SNCA质粒,将其转染至HEK293人胚肾细胞中,经Western blotting鉴定Halo-SNCA融合蛋白质的表达... 详细信息

目的探讨halotag技术用于α-突触核蛋白质(α-synuclein,SNCA)在细胞内荧光成像及半定量分析的方法及其应用。方法采用重组克隆技术构建pHalo-SNCA质粒,将其转染至HEK293人胚肾细胞中,经Western blotting鉴定Halo-SNCA融合蛋白质的表达;通过激光共聚焦显微镜观察Halo-SNCA在细胞内的定位与分布;通过蛋白酶催化的解偶联反应的荧光强度测定细胞内Halo-SNCA的荧光强度进行目的蛋白质的间接定量分析。结果本研究成功构建了Halo-SNCA真核表达质粒,能够在转染的真核细胞中高效表达目的融合蛋白质,该融合蛋白质结合特定的荧光配基后,可通过激光共聚焦显微成像分析Halo-SNCA在细胞中的动态水平与分布状况。此外,经水解释放的荧光配基可用于表达融合蛋白质在细胞中较为精确的相对定量分析。结论halotag技术能够用于SNCA在细胞内成像和定量分析,同时可以作为细胞生物学和生物化学分析的可关联检测指标。对于SNCA的生理功能以及在神经系统病变中的作用等相关研究,halotag具有令人瞩目的潜在应用前景。

关键词： halotag α-突触核蛋白质荧光成像定量分析

以halotag为靶点的蛋白降解药物细胞筛选模型的建立及应用

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中国海洋药物 2024年第4期43卷 42-50页

作者：张成玮张文开李宝虎马梦君孙俊张思琪葛玲马树敏中国海洋大学海洋药物教育部重点实验室医药学院山东青岛266003 青岛普泰科生物医药科技有限公司山东青岛266042

目的构建稳定表达halotag蛋白的细胞筛选模型,用于蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)降解剂的活性筛选和E3泛素连接酶配体的开发。方法采用慢病毒技术分别构建稳定表达HA-Halo(细胞质定位)和FlagHalo-NLS(细胞核定位)蛋白的HEK-293T细胞株;... 详细信息

目的构建稳定表达halotag蛋白的细胞筛选模型,用于蛋白水解靶向嵌合体(PROTAC)降解剂的活性筛选和E3泛素连接酶配体的开发。方法采用慢病毒技术分别构建稳定表达HA-Halo(细胞质定位)和FlagHalo-NLS(细胞核定位)蛋白的HEK-293T细胞株;采用Western Blotting检测halotag降解剂VHL-HP3靶向降解HA-Halo和Flag-Halo-NLS蛋白的水平。结果成功构建了稳定表达HA-Halo和Flag-Halo-NLS蛋白的HEK-293T的细胞模型;化合物VHL-HP3能显著降解HA-Halo和Flag-Halo-NLS蛋白的水平,且在0.3μmol/L时均表现出显著的降解活性。结论稳定表达halotag蛋白的细胞株,可作为以halotag蛋白为靶点的PROTAC降解剂活性筛选的模型细胞,为海洋药物来源的E3泛素连接酶配体的开发提供了高通量的筛选方法。

关键词： halotag 蛋白水解靶向嵌合体稳转细胞株活性筛选

GoldCLIP： Gel-omitted Ligation-dependent CLIP

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Genomics, Proteomics & Bioinformatics 2018年第2期16卷 136-143页

作者： Jiaqi Gu Ming Wang Yang Yang Ding Qiu Yiqun Zhang Jinbiao Ma Yu Zhou Gregory J. Hannon Yang Yu State Key Laboratory of Genetic Engineering Department of Biochemistry School of Life Sciences Fudan University Shanghai 200438 China CAS Key Laboratory of RNA Biology Institute of Biophysics Chinese Academy of Sciences Beijing 100101 China Hubei Key Laboratory of Cell Homeostasis College of Life Sciences Wuhan University Wuhan 430072 China Cancer Research UK Li Ka Shing Centre University of Cambridge Cambridge CB2 ORE United Kingdom

Protein-RNA interaction networks are essential to understand gene regulation control. Identifying binding sites of RNA-binding proteins （RBPs） by the UV-crosslinking and immunoprecipitation （CLIP） represents one of the most powerful methods to map protein RNA interactions in vivo. However, the traditional CLIP protocol is technically challenging, which requires radioactive labeling and suffers from material loss during PAGE-membrane transfer procedures. Here we introduce a super-efficient CLIP method （GoldCLIP） that omits all gel purification steps. This nonisotopic method allows us to perform highly reproducible CLIP experiments with polypyrimidine tract-binding protein （PTB）, a classical RBP in human cell lines. In principle, our method guarantees sequencing library constructions, providing the protein of interest can be successfully crosslinked to RNAs in living cells. GoldCLIP is readily applicable to diverse proteins to uncover their endogenous RNA targets.

关键词： RNA binding protein UV crosslinking CLIP halotag PTB

MDA-7/IL-24-HT7融合蛋白的制备及其对肿瘤细胞凋亡的诱导作用

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中国肿瘤生物治疗杂志 2010年第4期17卷 386-391页

作者：刘新建徐萍钱其军黄倩上海交通大学癌基因及相关基因国家重点实验室上海200032 上海交通大学生命科学技术学院上海200240 复旦大学附属眼耳鼻喉科医院实验中心上海200032 第二军医大学东方肝胆外科医院基因一病毒治疗实验室上海200438 上海交通大学附属第一人民医院中心实验室上海200080

目的:构建MDA-7/IL-24-HT7原核及真核表达质粒,制备MDA-7/IL-24-HT7融合蛋白,研究该融合蛋白在肿瘤细胞内的定位及其对肿瘤细胞致凋亡作用。方法:PCR扩增MDA-7/IL-24基因,插入含有halotag(HT7)标签的载体中,构建MDA-7/IL-24-HT7原核及... 详细信息

目的:构建MDA-7/IL-24-HT7原核及真核表达质粒,制备MDA-7/IL-24-HT7融合蛋白,研究该融合蛋白在肿瘤细胞内的定位及其对肿瘤细胞致凋亡作用。方法:PCR扩增MDA-7/IL-24基因,插入含有halotag(HT7)标签的载体中,构建MDA-7/IL-24-HT7原核及真核表达质粒;MDA-7/IL-24-HT7融合蛋白经IPTG诱导表达后纯化。利用带有荧光标记的HT7配基观察MDA-7/IL-24-HT7在肿瘤细胞内的定位。MTT法及AnnexinV-PI染色法检测MDA-7/IL-24-HT7对肿瘤细胞生长和凋亡的影响。结果:成功构建了表达MDA-7/IL-24-HT7融合蛋白的原核及真核表达质粒,MDA-7/IL-24-HT7融合蛋白主要存在于***21的包涵体内。MDA-7/IL-24-HT7融合蛋白定位于肿瘤细胞的内质网上。MDA-7/IL-24-HT7融合蛋白可抑制肿瘤细胞的生长,1mg/mlMDA-7/IL-24-HT7融合蛋白作用大肠癌HCT116细胞、肝癌SMMC7721细胞96h后,细胞凋亡率分别为(34.7±1.3)%和(22.1±0.9)%,显著高于未处理的肿瘤细胞(Phalotag标签的MDA-7/IL-24-HT7融合蛋白可抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡。

关键词： MDA-7/IL-24 halotag 融合蛋白肝肿瘤大肠肿瘤凋亡

戊型肝炎病毒ORF2蛋白与新型融合标签Halo Tag的融合表达

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中国生物制品学杂志 2012年第12期25卷 1583-1586页

作者：马天武黄芬井申荣曾韦锟禹文海昆明理工大学生命科学与技术学院昆明650500 中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所医学灵长类中心实验动物部昆明650118

目的在大肠杆菌KRX中表达戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus,HEV）ORF2与新型融合标签Halo Tag融合蛋白。方法采用RT-PCR法从4型HEV毒株中扩增ORF2基因部分片段（aa 382~620）,插入含新型融合标签Halo Tag的原核表达载体pFN18the中,构建... 详细信息

目的在大肠杆菌KRX中表达戊型肝炎病毒（Hepatitis E virus,HEV）ORF2与新型融合标签Halo Tag融合蛋白。方法采用RT-PCR法从4型HEV毒株中扩增ORF2基因部分片段（aa 382~620）,插入含新型融合标签Halo Tag的原核表达载体pFN18the中,构建重组表达质粒pFN18the-ORF2,转化大肠杆菌KRX,鼠李糖诱导表达Halo-ORF2融合蛋白,纯化后Western blot分析融合蛋白的反应原性。结果经RT-PCR扩增出717 bp的目的基因片段;重组表达质粒pFN18the-ORF2经双酶切和测序鉴定构建正确;表达的融合蛋白Halo-ORF2相对分子质量为57 900,表达量约占菌体总蛋白的15%,以包涵体形式表达,纯化后纯度达90%以上,可与HEV IgG阳性血清特异性结合。结论在大肠杆菌KRX中表达了Halo-ORF2融合蛋白,为HEV结构蛋白抗原表位的筛选及戊肝血清学诊断的研究奠定了基础。

关键词：肝炎病毒,戊型 ORF2蛋白 halotag 融合蛋白原核细胞基因表达

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缩硫脲类荧光探针分子的合成

军事医学 2013年第7期37卷 539-542页

作者：黄亚飞钟武李松中南大学湘雅医学院药学院长沙410013 军事医学科学院毒物药物研究所北京100850

目的合成带有Halo-tag专属性配基小分子的缩硫脲(缩氨基硫脲)化合物,作为研究抗肿瘤金属螯合剂作用机制的探针分子。方法以相应的酮为原料与肼基甲硫酸甲硫酯缩合,缩合物用2-(2-氨基乙氧基)乙醇取代其中甲硫基,得到重要中间体3酮缩4-[2-... 详细信息

目的合成带有Halo-tag专属性配基小分子的缩硫脲(缩氨基硫脲)化合物,作为研究抗肿瘤金属螯合剂作用机制的探针分子。方法以相应的酮为原料与肼基甲硫酸甲硫酯缩合,缩合物用2-(2-氨基乙氧基)乙醇取代其中甲硫基,得到重要中间体3酮缩4-[2-(2-羟基乙氧基)乙基]氨基硫脲,最后再与6-氯-1-溴己烷发生亲核取代反应生成目标化合物酮缩4-(2-[2-(6-氯己氧基)乙氧基]乙基)-3-氨基硫脲。目标化合物结构经1H-NMR、13C-NMR和LC-MS确认。结果与结论建立了抗肿瘤金属螯合剂与Halo-tag的专属性配基分子结合的制备路线,合成了3个连接Halo-tag专属性配基和高活性抗肿瘤金属螯合剂的探针分子,为研究该类抗肿瘤金属螯合剂的作用机制提供了工具分子。

关键词： halotag 连接子金属螯合剂抗肿瘤