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糖基化聚肽纳米囊泡的构筑、蛋白和激动剂共递送及免疫活性

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高分子学报 2023年第10期54卷 1533-1546页

作者：宋莹莹葛玮董常明上海交通大学化学化工学院上海200240

为构建兼具细胞靶向和免疫活性的生物降解聚合物纳米载体,报道了3种糖基修饰的线形聚肽-含糖树枝化共聚物构筑的纳米囊泡及在蛋白抗原和免疫激动剂共递送载体中的应用.通过透析法制备了共负载卵清蛋白(OVA)和免疫激动剂咪喹莫特(R837)... 详细信息

为构建兼具细胞靶向和免疫活性的生物降解聚合物纳米载体,报道了3种糖基修饰的线形聚肽-含糖树枝化共聚物构筑的纳米囊泡及在蛋白抗原和免疫激动剂共递送载体中的应用.通过透析法制备了共负载卵清蛋白(OVA)和免疫激动剂咪喹莫特(R837)的糖聚肽纳米囊泡(PNLys-4Man、PNLys-4Gal、PNLys-4Glu),显示出糖基依赖性的促进树突状细胞(DC)熟化的免疫佐剂效应,且甘露糖修饰的纳米囊泡具有靶向DC细胞而增强的免疫活性;施加紫外光促使OVA和R837胞内快速释放,显著提高了DC细胞熟化和免疫相关共刺激因子的分泌水平,说明糖聚肽纳米囊泡及OVA抗原、R837激动剂具有协同促进DC细胞熟化的免疫活性.

关键词：糖聚肽纳米囊泡蛋白递送激动剂免疫佐剂

新型细胞穿膜肽P2穿膜特性的生物信息学分析及介导HaloTag蛋白胞内递送定位的实验研究

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新型细胞穿膜肽P2穿膜特性的生物信息学分析及介导HaloTag蛋白胞...

作者：郭向丽三峡大学

学位级别：硕士

研究背景:细胞穿膜肽(Cell Penetrateing Peptide,CPP)是一类能够携带蛋白及其他生物大分子入胞的非病毒基因载体。目的:本实验旨在研究新型细胞穿膜肽P2穿膜效率及其作为载体介导自标记标签蛋白—HaloTag蛋白入胞效率和递送定位,为更... 详细信息

研究背景:细胞穿膜肽(Cell Penetrateing Peptide,CPP)是一类能够携带蛋白及其他生物大分子入胞的非病毒基因载体。目的:本实验旨在研究新型细胞穿膜肽P2穿膜效率及其作为载体介导自标记标签蛋白—HaloTag蛋白入胞效率和递送定位,为更深一步应用P2这一新型细胞穿膜肽作为生物大分子运输载体在胞内的递送定位提供理论支持。方法:(1)通过生物信息学方法及结合已报道的CPPs结构特征,设计并合成出带有荧光素标签的P2-FITC、NCO-FITC等短肽,预测和检测其理化性质、结构特征和穿膜活性等。(2)将P2、NCO与细胞体外一起孵育,荧光显微镜定性观察胞内的绿色荧光分布,以及结合荧光酶标仪、全波长酶标仪量化胞内的荧光强度,分析在时间、浓度以及不同细胞系或同其他CPPs比较等条件下P2进入细胞的荧光量变化。(3)在温度梯度及不同抑制剂孵育条件下,分别定性和定量检测P2穿膜效率受到的影响,并结合生物信息学预测肽与膜之间相互作用进一步初步判断和分析P2可能的穿膜机制。(4)通过MTT实验检测P2对细胞增殖的影响,溶血实验、乳酸脱氢酶(LDH)释放实验分析P2对细胞的磷脂双层膜完整性的影响等进一步检测P2对细胞是否具有毒性影响。(5)构建原核表达质粒p ET15b-HaloTag-P2、p ET15b-HaloTag-Dot1l、p ET15b-HaloTag并诱导表达和纯化出融合蛋白HaloTag-P2、HaloTag-Dot1l、HaloTag,分别与细胞孵育后加入HaloTag配基—TMR继续孵育后固定,单独的TMR作空白对照,通过Bio Tek成像系统定性观察融合蛋白HaloTag-P2、HaloTag-Dot1l、HaloTag在胞内递送的示踪定位,用Image J软件定量分析融合蛋白在胞内的递送效率及阳性细胞所占细胞数量比。结果:(1)应用生物信息学方法对P2理化性质、结构及穿膜效率进行了较为准确的预测。(2)低浓度至高浓度的P2均穿透细胞膜,荧光强度与浓度呈正相关;P2穿膜效率在短时间内,荧光量随着时间延长累积增多;P2的穿膜作用没有细胞选择特异性,5%DMSO可以明显提高P2的穿膜效率。(3)低温对P2的穿膜效率略有影响;血清、肝素、EIPA、Chlorpromazine的存在可以抑制P2的穿膜效率,内吞抑制剂Na N、NHCl、MβCD、wortmannin、高渗蔗糖对P2的穿膜效率的抑制不显著。(4)P2的穿膜作用对细胞无明显毒性影响。(5)P2可以介导蛋白大分子物质如HaloTag蛋白递送入胞并主要分布于细胞核。结论:(1)P2是具有较高穿膜效率的新一类细胞穿膜肽;(2)P2的穿膜机制可能是通过内吞途径;(3)P2没有明显的细胞毒性;(4)P2能够介导HaloTag蛋白胞内递送;(5)HaloTag-P2作为新型探针主要定位于胞核,少量定位在胞浆。

关键词：细胞穿膜肽 P2 蛋白递送 HaloTag

联用微流控技术和光点击化学法构建小尺寸智能纳米凝胶用于蛋白质和siRNA的CD44介导的细胞质递送

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联用微流控技术和光点击化学法构建小尺寸智能纳米凝胶用于蛋白质...

作者：黄珂苏州大学

学位级别：硕士

恶性肿瘤严重威胁着人类的健康。蛋白质药物和核酸药物因具有高选择性、优越的功效和低副作用而在肿瘤治疗中展现出巨大的潜力,但它们通常存在体内循环时间短、易酶解、内吞进入肿瘤细胞效率低等缺点。为此,人们设计制备了纳米凝胶、脂... 详细信息

恶性肿瘤严重威胁着人类的健康。蛋白质药物和核酸药物因具有高选择性、优越的功效和低副作用而在肿瘤治疗中展现出巨大的潜力,但它们通常存在体内循环时间短、易酶解、内吞进入肿瘤细胞效率低等缺点。为此,人们设计制备了纳米凝胶、脂质体、聚合物囊泡和聚合物纳米粒子等纳米递送载体来实现蛋白药物和siRNA在肿瘤细胞内的高效递送。论文第一章介绍了近年来蛋白质药物和核酸药物用于癌症治疗的现状,着重介绍了纳米凝胶的构建策略及其在蛋白药物递送中的应用,同时概述了用于siRNA递送的多种纳米载体平台。第二章,我们设计制备了小粒径、可示踪、能逃离内涵体和具有生物响应性的透明质酸纳米凝胶（NG）用于蛋白药物的CD44介导的细胞质递送。NG是用透明质酸的胱胺甲基丙烯酸（HA-Cys-MA）和四唑（HA-Lys-Tet）衍生物通过联用微流控技术和无催化剂的光点击化学反应制备得到。通过调控微流控的流速、聚合物浓度及透明质酸的链长,我们能方便制得尺寸均一和粒径可控的纳米凝胶。同时,该NG具有强的绿色荧光,且能高效包载皂草毒素、细胞色素C、赫赛汀、免疫球蛋白G和牛血清白蛋白等不同种类的蛋白类药物。细胞实验显示,不论是在CD44高表达的4T1、MDA-MB-231乳腺癌细胞还是在CD44低表达的U87胶质瘤细胞中,粒径为80 nm的NG组（NG-80）都比粒径为150 nm的NG组（NG-150）内吞进入肿瘤细胞的能力更强。而且,引入pH敏感的融合肽GALA能更进一步提高NG逃离内涵体的能力。包载皂草毒素的GALA修饰的NG-80在4种CD44高表达的肿瘤细胞内（4T1、MDA-MB-231乳腺癌细胞,SMMC-7721肝癌细胞,A549肺癌细胞）均展现出最大的细胞毒性,其半致死浓度（IC50）值约为NG-150的一半。体内实验发现NG-150组有更长的循环时间,而NG-80在4T1肿瘤部位富集量更高,这可能是因为小尺寸纳米凝胶的肿瘤穿透距离更深。因此,通过微流控和光点击化学制备的纳米凝胶具有尺寸小、均一可控和生物响应性,在肿瘤靶向蛋白治疗中有较大的潜力。第三章,我们在第二章开发的纳米凝胶体系中引入锌-二甲基吡啶胺（Zn-DPA）,从而实现小干扰RNA（siRNA）的高效包载、内涵体高效逃逸、靶向递送和有效基因沉默。该纳米凝胶（NG/Zn-DPA）是用透明质酸的胱胺甲基丙烯酸酯衍生物（HA-Cys-MA）和四唑/Zn-DPA衍生物（HA-Lys-Tet/Zn-DPA）通过联用微流控技术和无催化剂的光点击化学反应制备得到。NG/Zn-DPA能高效包载siRNA,在理论包载量为10 wt.%时,实际包载量高达8.9 wt.%。NG/Zn-DPA对siRNA优越的包载能力主要是因为纳米凝胶中的Zn-DPA与siRNA上的磷脂基团存在较强的配位键作用。包载siRNA的NG/Zn-DPA的大小为125 nm,尺寸均一,且稳定性高。与不含Zn-DPA的NG相比,NG/Zn-DPA组能更好地内吞进入MDA-MB-231乳腺癌细胞,其内吞量是NG组的5.1倍;同时NG/Zn-DPA能更有效地从肿瘤细胞的内涵体中逃离出来。这种大大增强的细胞内吞能力和内涵体逃逸能力主要是因为Zn-DPA能与细胞膜和内涵体膜上的磷脂基团作用,从而促进siRNA的细胞质递送。包载siRNA的NG/Zn-DPA能高效沉默肿瘤细胞中相关基因的表达。例如,包载siGL3的NG/Zn-DPA（NG/Zn-DPA-siGL3）在200 nM的浓度下48小时内可将HeLa-luc宫颈癌细胞的荧光素酶报告基因表达量下调71%,NG/Zn-DPA-siPLK1在相同浓度时能显著下调MDA-MB-231细胞中的PLK1 mRNA目标基因（73%）。此外,NG/Zn-DPA具有良好的生物相容性,在浓度高达600μg/mL时与MDA-MB-231细胞孵育48小时后,细胞存活率依然接近100%。因此,这种Zn-DPA修饰的纳米凝胶具有高稳定性,高载药效率,低毒性和高基因沉默效率,可望为核酸药物的高效靶向递送提供一类新型纳米平台。第四章对全文进行总结,并对下一步工作进行展望。

关键词：纳米凝胶微流控点击化学蛋白递送核酸递送肿瘤治疗

mPEG-PLGA-BSA-FITC-NPs纳米载体体外安全性与有效性评估

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临床耳鼻咽喉头颈外科杂志 2015年第1期29卷 48-51,56页

作者：陈志婷吴南邓雄威王方园李坤郭维维刘日渊袁硕龙张嘉坤杨仕明解放军总医院耳鼻咽喉头颈外科解放军耳鼻咽喉研究所聋病教育部重点实验室北京100853 中国科学院国家纳米科学中心

目的:构建并获得mPEG-PLGA-BSA-FITC-NPs载蛋白复合物,评估mPEG-PLGA载体体外递送目的蛋白对Hela细胞的有效率及安全性,以筛选适用于内耳疾病治疗的理想的、具有缓释特性的多肽、蛋白质类药物递送载体材料。方法:应用mPEG化学修饰PLGA... 详细信息

目的:构建并获得mPEG-PLGA-BSA-FITC-NPs载蛋白复合物,评估mPEG-PLGA载体体外递送目的蛋白对Hela细胞的有效率及安全性,以筛选适用于内耳疾病治疗的理想的、具有缓释特性的多肽、蛋白质类药物递送载体材料。方法:应用mPEG化学修饰PLGA纳米材料作作为递送载体,携带标记有异硫氰酸荧光素(FITC)的牛血清白蛋白(BSA),体外转导Hela细胞,选择不同的时间利用激光共聚焦荧光显微镜观察细胞递送效率并对阳性细胞计数,计算评估递送有效率,采用MTT法检测不同时间点mPEG-PLGA-BSA-FITC-NPs载体复合物的体外细胞安全性。结果:mPEG-PLGA-BSA-FITC-NPs呈现经典纳米尺寸大小,包封率达到(51.2±2.3)%,且具有持续、缓慢释放的特性,在优化的体外递送条件下,mPEG-PLGA-BSA-FITC-NPs体外递送蛋白有效率最高达到了63.7%以上;同时,在mPEG-PLGA-BSA-FITC-NPs递送效率达到最佳的条件下,细胞安全性为85.7%。结论:mPEG-PLGA-BSA-FITC-NPs纳米复合物作为一种新型的、安全有效的纳米蛋白递送载体材料,能够成功携带靶向蛋白体外递送细胞,且具有缓慢释放特性,能够为未来应用纳米材料进行感音神经性聋的治疗提供良好的载体系统。

关键词： mPEG-PLGA 纳米载体蛋白递送

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定点原位生长蛋白质-高分子偶联物

定点原位生长蛋白质-高分子偶联物

高酶载量的金属—有机框架用于肿瘤光热免疫治疗

中国化学会2017全国高分子学术论文报告会

作者：高卫平清华大学医学院生物医学工程系

蛋白质-高分子偶联物兼具蛋白质特性（如结构与功能精准可控、生物活性等）与高分子特性（如可调控的化学与物理性质等）,是一类重要的生物偶联物,可广泛用于药物/生物大分子递送、分子影像/诊断等生物医药领域。通常,蛋白质-高分子偶... 详细信息

蛋白质-高分子偶联物兼具蛋白质特性（如结构与功能精准可控、生物活性等）与高分子特性（如可调控的化学与物理性质等）,是一类重要的生物偶联物,可广泛用于药物/生物大分子递送、分子影像/诊断等生物医药领域。通常,蛋白质-高分子偶联物是由高分子链的一端以共价键的形式无规地连接到蛋白质表面的赖氨酸或半胱氨酸残基的反应性侧基上而形成的,其中聚乙二醇（PEG）是最为广泛使用的高分子,且已有12个PEG化蛋白药物被FDA批准用于临床治疗。但是PEG化技术存在偶联位点非特异性以及产率低等问题,制约了PEG化技术的广泛应用。为了解决这些关键共性科学问题,近年来我们将化学生物学与高分子化学有机结合,研发了定点原位生长（SIG）技术,高效制备出位点特异性蛋白质-高分子偶联物,并将其用于蛋白递送与分子诊断。

关键词：蛋白质工程蛋白质化学蛋白质-高分子偶联物蛋白递送

来源： cnki会议评论

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高酶载量的金属—有机框架用于肿瘤光热免疫治疗

作者：桂文涛中国科学技术大学

学位级别：硕士

金属-有机框架(Metal-Organic Frameworks,MOFs)材料因其种类多样、高孔隙率、良好的生物降解性、易官能化以及性能可调节等特点成为良好的药物载体,在肿瘤的治疗中被广泛应用。但是MOFs材料中较高的金属离子浓度、有机配体的潜在毒性... 详细信息

金属-有机框架(Metal-Organic Frameworks,MOFs)材料因其种类多样、高孔隙率、良好的生物降解性、易官能化以及性能可调节等特点成为良好的药物载体,在肿瘤的治疗中被广泛应用。但是MOFs材料中较高的金属离子浓度、有机配体的潜在毒性和制备过程涉及的有机溶剂等固有的危险因素限制了其临床应用。MOFs载药纳米颗粒递送过程中经历的一系列生理屏障也严重阻碍药物的运输,削弱治疗效果。本研究中,我们以一步法制备了一种包封胶原酶的金属-有机框架(MOFCol)。在MOFCol制备过程中,我们先将低含量的Zn(Ⅱ)与胶原酶混合孵育,在蛋白表面形成组氨酸残基与Zn(Ⅱ)配位结合的节点。之后再加入2-甲基咪唑进一步配位组装构建MOFs结构,故而MOFCol具有极低的金属离子含量和较高的负载量(～80 wt%),较传统高 Zn(Ⅱ)含量沸石咪唑框架-8(Zeolitic Imidazolate Framework-8,ZIF-8)矿化负载胶原酶的体系Collagenase@ZIF-8具有更低的生物毒性。MOFCol在酸性环境下可以发生解离,响应性释放胶原酶,进而恢复胶原酶活性。胶原蛋白是细胞外间质的重要组成部分,在维持肿瘤完整性、阻碍药物的渗透和削弱免疫细胞浸润等方面起到重要作用。通过对荷瘤小鼠静脉注射MOFCol,向肿瘤组织中递送胶原酶,成功诱导了肿瘤组织胶原蛋白的降解。同时随着胶原蛋白的降解,肿瘤新生血管形成明显增加,ECM作为屏障的作用被削弱,纳米颗粒在肿瘤组织的穿透和免疫细胞的浸润得到增强。我们将近红外二区光热剂FD1080负载于MOFCol纳米颗粒上形成MOFCol/FD进行共递送,通过光热治疗成功诱导体外肿瘤细胞免疫原性死亡(Immunogenic Cell Death,ICD)。进一步以免疫原性死亡细胞为疫苗,证明光热诱导的肿瘤细胞免疫原性死亡可以促进肿瘤组织中免疫细胞的浸润,对肿瘤生长起到抑制作用。最后在荷瘤小鼠模型的治疗中,以MOFCol/FD结合免疫检查点阻断剂抗PD-1抗体协同治疗,表现出较好的治疗效果。

关键词：金属-有机框架蛋白递送细胞外基质光热治疗免疫治疗

膜融合型纳米囊泡用于嵌合抗原受体修饰免疫细胞构建的研究

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膜融合型纳米囊泡用于嵌合抗原受体修饰免疫细胞构建的研究

作者：罗佳钰华南理工大学

学位级别：硕士

嵌合抗原受体（CAR）修饰的免疫细胞疗法已成为一种极具前景的肿瘤治疗策略。其中,CAR修饰的T细胞疗法已有8款产品上市,在血液瘤治疗中取得了优异的效果。此外,CAR也被用于修饰其他免疫细胞,如NK细胞或巨噬细胞（MΦ）。CAR分子是由胞... 详细信息

嵌合抗原受体（CAR）修饰的免疫细胞疗法已成为一种极具前景的肿瘤治疗策略。其中,CAR修饰的T细胞疗法已有8款产品上市,在血液瘤治疗中取得了优异的效果。此外,CAR也被用于修饰其他免疫细胞,如NK细胞或巨噬细胞（MΦ）。CAR分子是由胞外抗原结合域、跨膜域和胞内信号转导域组成的合成受体,可特异性结合靶抗原并传递激活信号给免疫细胞。该疗法的关键步骤—将CAR分子修饰至免疫细胞,目前主要通过病毒载体转导完成,存在基因随机整合导致的突变风险,且制备过程冗长复杂,阻碍了CAR细胞疗法的推广。因此,开发一种更具安全性、便捷性的CAR分子递送载体助力CAR细胞疗法成为研究热点。启发于自然界中膜融合过程可实现物质转运,本研究构建了一种膜融合型纳米囊泡（Fu-EVs）作为CAR分子的递送载体,通过囊泡膜与待修饰的免疫细胞膜发生融合,实现将CAR分子递送至免疫细胞表面,从而快速、便捷地制备出CAR细胞。且该囊泡为细胞外囊泡,具有生物相容性高、免疫原性低的特点。本论文中膜融合型纳米囊泡的构建过程为:先通过瞬时转染使细胞表达膜融合蛋白（p14 FAST或VSVG）,再利用表面活性剂处理使该细胞分泌携载膜融合蛋白的细胞外囊泡,即膜融合型纳米囊泡（Fu-EVs）。论文首先检测了Fu-EVs发生膜融合的条件,以及与不同细胞膜融合的效率。在此基础上,通过同时转染膜融合蛋白和CAR分子的表达质粒于细胞,制备得到携载CAR分子的膜融合型纳米囊泡(Fu-EV)。论文中利用携载anti-CD19（αCD19）CAR分子的膜融合型纳米囊泡(Fu-EV)成功制备了CAR-T/MΦ/Jurkat细胞,并在细胞水平上证明制备的CAR-T/MΦ细胞对CD19A20细胞具有良好的识别作用,发挥一定的杀伤或吞噬效果。随后,在动物水平上证明Fu-EV制备的CAR-MΦ对A20皮下瘤的生长具有良好的抑制效果。综上,本研究构建了一种安全有效的非病毒载体Fu-EVs,可将CAR分子直接递送至免疫细胞表面实现CAR细胞的制备,具备良好的生物相容性和安全性,为CAR细胞的制备提供了一种安全性高、操作简单的新策略。

关键词：纳米囊泡膜融合蛋白递送嵌合抗原受体修饰免疫细胞肿瘤免疫治疗