水杨酸脱羧酶的晶体结构及分子改造研究

作     者：程晓涛 

作者单位：天津科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：路福平

授予年度：2020年

学科分类：081702[工学-化学工艺] 081705[工学-工业催化] 08[工学] 0817[工学-化学工程与技术] 080502[工学-材料学] 0805[工学-材料科学与工程（可授工学、理学学位）] 

主      题：水杨酸脱羧酶 酶学表征 晶体结构 分子改造 底物特异性 

摘      要：一些具有可逆功能的非氧化脱羧酶可在温和的条件下,选择性地将一些酚类物质羧化生成相应的羟基苯甲酸,为一些药物和化工原料的生产提供了新思路。水杨酸是一种结构简单的羟基苯甲酸,是食品,精细化工和医药行业的重要原料和中间体,可用于生产乙酰水杨酸（阿司匹林）,然而水杨酸的化学合成工艺复杂,还会产生大量的副产物,因此生物酶法生成水杨酸由于其较强的催化特异性而备受关注。本论文鉴定了丝孢酵母Trichosporon moniliiforme WU-0401来源的水杨酸脱羧酶（Sdc）,该酶可以催化水杨酸脱羧与苯酚相互转化的可逆反应由,将该酶作为研究对象,对其进行了表达、纯化、产物鉴定、酶学表征、结晶化、结构解析、底物选择性分析及分子特异性改造研究,主要研究情况如下。（1）对水杨酸脱羧酶基因（Sdc）进行了克隆及重组载体的构建,实现了其在*** BL21（DE3）中的高效可溶性表达,经镍离子亲和层析和Resource Q阴离子交换层析得到了高纯度的Sdc蛋白（纯度97%）。活性检测和产物分析证明了 Sdc具有催化可逆反应由水杨酸脱羧生成苯酚或者由苯酚羧化生成水杨酸的功能,且在催化苯酚的羧化反应时,产物仅有水杨酸,而无间羟基苯甲酸或对羟基苯甲酸生成。酶学性质和酶动力学研究表明Sdc在进行脱羧反应时的最适温度为50℃,最适缓冲液为MES-NaOH（pH 5.5）,进行羧化反应时的最适温度为30℃,最适KHCO3缓冲液浓度为2.5M,最适金属离子Zn2+,最适条件下脱羧反应和羧化反应的Km分别为1.14,81.34 mM,kcat/Km为 3.17,0.011 s-1mM-1。（2）对Sdc进行结晶条件的筛选和优化,其最佳结晶条件为0.1 M HEPES（pH 8.5）、32%PEG400、200mMNaCl,在此基础上进行了 Sdc与水杨酸的共结晶。得到的晶体经X-衍射收集数据后,再经HKL2000和CCP4软件处理和解析,分辨率分别达到了 1.44、1.67 A。Sdc的三维结构是传统的TIM-barrel结构,由15个α螺旋和10个β 折叠组成,底物水杨酸被 Y27、H169、P191、F195、H224、D298、Y301、Zn2+以及相邻蛋白分子的R235、W239包围,此外,活性中心的Zn2+还有3个配体氨基酸,分别是 E8、H169、D298。（3）为了获得催化活性或者催化效率更高的Sdc突变体,通过分析Sdc的三维结构,选取底物结合域附近的氨基酸位点进行理性设计和分子改造。经过筛选后,获得了高性能突变体Y64T,Y64T对水杨酸的脱羧活性较野生型提高了 0.8倍,催化效率提高了 0.82倍,结构分析表明,Y64T突变体扩大了活性中心的内腔;而活性中心Zn2+配位的3个氨基酸中任何一个发生突变后,都会完全丧失活性,说明该配位体结构对其催化活性的发挥至关重要。底物特异性结果表明,Sdc还可催化2,4-二羟基苯甲酸和2,6-二羟基苯甲酸脱羧生成间苯二酚,催化2,3-二羟基苯甲酸脱羧生成邻苯二酚,但不能催化3-羟基苯甲酸、4-羟基苯甲酸、3,4-二羟基苯甲酸、3,5-二羟基苯甲酸的脱羧反应,说明Sdc能够特异性地识别羟基苯甲酸上与羟基相邻的羧基。