检索结果-南通市图书馆

西太海山区细菌来源酯酶的筛选、酶学表征及晶体结构研究

维普期刊数据库

同方期刊数据库

同方期刊数据库评论

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

西太海山区细菌来源酯酶的筛选、酶学表征及晶体结构研究

作者：施晓威江苏大学

学位级别：硕士

酯酶作为传统的工业酶制剂,被广泛应用于食品、有机合成、生物制药等工业生产领域。微生物来源的酯酶因其优异的酶学特性,在工业应用中表现尤为突出。西太海山区的环境特殊性、生物多样性以及深海环境的未开发性,为挖掘具有食品工业应... 详细信息

酯酶作为传统的工业酶制剂,被广泛应用于食品、有机合成、生物制药等工业生产领域。微生物来源的酯酶因其优异的酶学特性,在工业应用中表现尤为突出。西太海山区的环境特殊性、生物多样性以及深海环境的未开发性,为挖掘具有食品工业应用潜力的新型酯酶提供了良好来源。本论文以西太海山区来源的细菌为研究对象,采用基因预测分析法从基因组中筛选酯酶基因,通过异源表达与纯化,对筛得的酯酶进行酶学表征和晶体结构研究,为进一步研究酯酶的催化机制提供数据支持。从3株西太海山区来源的细菌基因组中筛选出14个假定酯酶,经过基因克隆、异源表达与纯化,确定了表达量高且性质稳定的四个酯酶Ala2、Muo3、Aln1和Aln10为研究对象,对其进行酶学表征。酯酶Ala2和Aln10的最适底物是对硝基苯酚己酸酯,酯酶Muo3和Aln1的最适底物是对硝基苯酚乙酸酯;都属于中温酯酶,在45～55°C范围内表现出最大活性;p H适应范围较广,在中性和碱性条件下均能保持较高活性;能耐受多种有机溶剂。Muo3、Aln1和Aln10具有良好的热稳定性,Aln10有较好的金属离子耐受性,Muo3有很好的Na Cl及去垢剂耐受性。对酶学性质突出、具有良好耐盐性的酯酶Muo3进行了晶体结构研究,采用X射线衍射晶体分析法对晶体进行衍射数据收集,并利用分子置换法进行晶体结构解析,获得了分辨率为1.36（?）的酯酶Muo3的晶体结构。酯酶Muo3晶体的每个不对称单元中包含两个酯酶分子,各含有10个α螺旋和11个β折叠,组成催化三联体的残基是第116位的Ser、第170位的Asp和第201位的His。酯酶Muo3晶体结构的成功解析为研究酯酶结构和催化机制提供了数据支持。本论文通过基因预测分析法筛选酯酶基因,经异源表达与纯化得到了具有优良酶学性质的4个酯酶Ala2、Muo3、Aln1和Aln10,并成功解析了酯酶Muo3的晶体结构,为酯酶催化机制的研究及新型酶制剂的开发提供了理论基础。

关键词：西太海山区酯酶酶学表征晶体结构 X射线衍射

赤杆菌来源HSL家族酯酶的酶学表征与晶体结构研究

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

赤杆菌来源HSL家族酯酶的酶学表征与晶体结构研究

作者：洪利国江苏大学

学位级别：硕士

酯酶可催化酯类的水解、合成和酯交换,在真核生物和原核生物中广泛存在。食品、化妆品和医药等工业用酯酶大多为细菌来源,其中细菌HSL家族酯酶因底物谱较广且具有严苛条件的适应性等特点,已被应用于食品香料制备和食品安全检测。不同细... 详细信息

酯酶可催化酯类的水解、合成和酯交换,在真核生物和原核生物中广泛存在。食品、化妆品和医药等工业用酯酶大多为细菌来源,其中细菌HSL家族酯酶因底物谱较广且具有严苛条件的适应性等特点,已被应用于食品香料制备和食品安全检测。不同细菌来源HSL家族酯酶的催化特性差异较大,开展蛋白结构研究对解释其结构与催化特性之间的关系和指导酶工程改造至关重要。本研究从具有烷烃降解能力的赤杆菌基因组中筛选新型HSL家族酯酶,通过酶学表征和晶体结构研究,为细菌HSL家族酯酶的催化机制和功能研究提供数据支持。从13株赤杆菌科细菌基因组中利用序列比对筛选出12个HSL家族酯酶。经氨基酸序列分析以及通过基因克隆、异源表达和纯化,确定了两个可溶性表达量大、性质稳定酯酶Poc14和Pot7作为研究对象。其中,酯酶Poc14的分子量为35.7 kDa,酯酶Pot7的分子量大小为33.7 kDa。酶学性质表征结果显示酯酶Poc14和Pot7的最适底物都为对硝基苯酚己酸酯,最适反应条件:温度为55?C,pH为6.0–9.0。酯酶Poc14和Pot7具有较强的热稳定性,对NaCl、多种金属离子和有机溶剂具有很强的耐受性,并且相比Pot7,Poc14的耐受能力更强。此外,Poc14和Pot7都能降解邻苯二甲酸酯,表明酯酶Poc14和Pot7可用于邻苯二甲酸酯类物质的检测。对酯酶Poc14和Pot7开展蛋白结构研究,通过蛋白结晶,晶体X射线衍射数据的收集以及利用分子置换法进行晶体结构的解析,获得了分辨率为1.8?的酯酶Poc14的晶体结构和分辨率为2.1?的酯酶Pot7的晶体结构。酯酶Poc14和Pot7晶体结构的成功解析为研究HSL家族酯酶的结构、功能和催化机制提供了数据支持。综上所述,本研究通过生物信息学分析筛选得到了具有优良的酶学性质的HSL家族酯酶Poc14和Pot7,并成功解析了两个酯酶蛋白的晶体结构,为研究细菌HSL家族酯酶催化机制和功能奠定了基础,为食品工业提供了潜在的酶制剂。

关键词：赤杆菌酯酶异源表达酶学表征晶体结构

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

苯丙氨酸变位酶的催化性能表征

苯丙氨酸变位酶的催化性能表征

作者：丰国强安徽工程大学

学位级别：硕士

苯丙氨酸氨基变位酶(PAM)是一类以MIO(4-亚甲基-咪唑-5-酮)为辅因子的酶,MIO是一种新型的内源性辅因子,是酶蛋白质在翻译后折叠过程中经两次脱水环化而成的具有强亲电性的基团。MIO介导底物α-苯丙氨酸的Cα位的氨基变位至Cβ位,生成β... 详细信息

苯丙氨酸氨基变位酶(PAM)是一类以MIO(4-亚甲基-咪唑-5-酮)为辅因子的酶,MIO是一种新型的内源性辅因子,是酶蛋白质在翻译后折叠过程中经两次脱水环化而成的具有强亲电性的基团。MIO介导底物α-苯丙氨酸的Cα位的氨基变位至Cβ位,生成β-苯丙氨酸,完成其异构化反应即区域选择性催化反应,同时也能催化中间产物反式肉桂酸的不饱和双键的Cβ位加氨合成β-苯丙氨酸。不同来源的苯丙氨酸变位酶的立体选择性差异较大,如来源于紫杉(Taxus chinensis)的TcPAM催化的产物是R-β-苯丙氨酸,而来源于成团范菌(Pantoeaagglomeran)的PaPAM催化的产物是S-β-苯丙氨酸,由此可以看出区域选择性和立体选择性是苯丙氨酸氨基变位酶两个重要的酶学特性。课题组前期完成了PaPAM的克隆表达以及酶学性质表征,继续对TcPAM进行克隆表达及性质表征。首先化学合成来源于紫杉的氨基变位酶(Tcpam)基因,构建重组质粒pET-sumo-Tcpam,转入大肠杆菌中进行异源诱导表达制备重组酶及酶学性质进行初步研究。在此基础上,对TcPAM以及PaPAM进行突变,研究其对PAM的立体选择性和区域选择性的影响,主要研究结果如下:(1)重组质粒pET-sumo-Tcpam成功在大肠杆菌中实现高效表达,获得可溶性的重组TcPAM,经过亲和层析制备出电泳纯的重组TcPAM。HPLC和MS的结果证明了 TcPAM能够催化α-苯丙氨酸异构化为β-苯丙氨酸。TcPAM在最适温度30℃、pH9的条件下,酶活达到4.11 U/mg,而PaPAM在最适条件下,酶活仅有2.5 U/mg;金属离子Na+、K+、Fe2+和Ca2+对TcPAM和PaPAM的活性影响较小,而Cu2+和Zn2+导致TcPAM和PaPAM的活性具有明显抑制作用;表面活性剂 CTAB、SDS、Triton X-100 和 Tween 80 对重组酶 TcPAM 的活性影响较小,相对酶活保持在90%以上,却对重组酶PaPAM催化反应活性影响较大。比较重组酶TcPAM与PaPAM的酶活表征,发现两种酶具有较好pH稳定性,重组酶PaPAM具有较好的热稳定性,金属离子对重组酶TcPAM的影响较大,表面活性剂对重组 TcPAM 的较小。(2)通过对TcPAM和PaPAM的序列和结果进行比对,发现PaPAM的84位(TcPAM在相对应的位置是86位苯丙氨酸)的甲硫氨酸(M)和91位(TcPAM在相对应的位置是93位精氨酸)异亮氨酸(Ⅰ)对苯丙氨酸氨基变位的区域选择性和立体选择性有重要的影响。因而将TcPAM和PaPAM的这两个位点进行突变,获得PaPAM-M84F、PaPAM-191R、TcPAM-F86M 和 TcPAM-R93I 4 个突变体,研究其对酶催化活性的影响。PaPAM催化α-苯丙氨酸的转化率为25%,而PaPAM-M84F与PaPAM-191R能提高对α-苯丙氨酸催化效率,转化率分别为72.1%和27.9%。TcPAM催化α-苯丙氨酸的转化率为29.7%,TcPAM-F86M和TcPAM-R93I催化α-苯丙氨酸时,检测不到产物。则说明TcPAM和PaPAM的这两个位点的氨基酸对PAM的区域选择性具有影响。用TcPAM、PaPAM、PaPAM-M84F、PaPAM-I91R、TcPAM-F86M和TcPAM-R93I催化不同取代基的芳香丙氨酸,通过HPLC来检测产物的生成,来考察携带有不同取代基团对重组酶的区域选择性分析,得出底物上不同取代基的带电性质以及位置会影响PAM的区域选择性。(3)首先探究TcPAM与PaPAM催化α-苯丙氨酸产物的立体构型,通过HPLC和MS检测催化产物,并且利用圆二色性鉴定了催化产物的立体构型,得出PaPAM催化产物的立体构型为S-β-苯丙氨酸,TcPAM催化产物的立体构型为R-β-苯丙氨酸。利用HPLC手性分析柱检测 PaPAM-M84F、PaPAM-191 R、TcPAM-F86M 和 TcPAM-R93I的催化产物,研究其对立体选择性的影响。PaPAM的催化产物为95%ees的β-苯丙氨酸,而PaPAM-M84F与PaPAM-I91R的催化产物分别为1 8.8%ees和39.4%ees的β-苯丙氨酸。TcPAM的催化产物为95%eeR的β-苯丙氨酸,但是TcPAM-F86M和TcPAM-R93I检测不到产物。TcPAM、PaPAM、PaPAM-M84F、PaPAM-I91R、TcPAM-F86M和TcPAM-R931催化携带不同取代基的底物时,发现底物苯环上携带基团的种类以及位置不同也会影响PAM催化底物的立体选择性。

关键词：紫杉成团范菌苯丙氨酸氨基变位酶 β-芳香丙氨酸酶学表征

北京棒杆菌AS1.299高丝氨酸脱氢酶定点突变及酶学性质表征

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

北京棒杆菌AS1.299高丝氨酸脱氢酶定点突变及酶学性质表征

作者：许金坤吉林农业大学

学位级别：硕士

高丝氨酸脱氢酶(HSD)是天冬氨酸族氨基酸生物合成途径的关键酶,同时也是限速酶。它催化天冬氨酸p-半醛生成高丝氨酸,最终控制合成蛋氨酸、苏氨酸、异亮氨酸和S-腺苷蛋氨酸。微生物中天冬氨酸族氨基酸的生物合成受到严格的调控,为了提高... 详细信息

高丝氨酸脱氢酶(HSD)是天冬氨酸族氨基酸生物合成途径的关键酶,同时也是限速酶。它催化天冬氨酸p-半醛生成高丝氨酸,最终控制合成蛋氨酸、苏氨酸、异亮氨酸和S-腺苷蛋氨酸。微生物中天冬氨酸族氨基酸的生物合成受到严格的调控,为了提高产量,关键酶HSD的催化机制和酶分子改造成为研究的重点之一。本研究在成功克隆来源于北京棒杆菌HSD编码基因的基础上,利用定点突变技术对其进行突变。将突变体在***. BL21(DE3)中进行异源表达,采用镍柱纯化后,测定酶活力并进行酶学性质表征。通过电转化法将构建的含突变基因的穿梭表达质粒转入原菌,研究突变对蛋氨酸产量的影响。结果如下： 1. BLAST搜索同源性序列,以与北京棒杆菌AS1.299高丝氨酸脱氢酶同源性达到40%的Thiobacillus denitrificans高丝氨酸脱氢酶的晶体结构为模板,进行同源模建。采用AutoDock Vina进行分子对接确定重要HSD氨基酸残基;并通过同源序列比对分析保守序列,确定K112、L200和D206为重要残基。确定对HSD分别进行K112、L200和D206定点突变,测序确定突变体。 2.突变体在***21(DE3)中进行诱导表达,采用超声波破碎制备粗酶液,利用镍柱和SDS-PAGE分别纯化和检测目的蛋白,通过分光光度法检测酶活。动力学研究推测该酶具有别构作用,且n都大于1有正协同效应存在并进一步验证了HSD是别构酶。通过动力学参数显示,相对野生型L200突变体kcat/Km值变大,而Km值变小。表明L200位点参与底物结合,能够改变结合口袋形状和底物亲和力,进而改变酶催化效率。较野生型D206G,除Km减小外其他常数无变化,说明D206位点也在底物结合口袋附近。对于K112位点突变体Kcat/Km值分别为野生型的2.3、1.2和1.1倍,底物亲和力增加,表明K112位于辅助因子结合口袋,影响酶的空间结构从而进一步影响酶催化效率。 3.此外对动力学参数变化显著的L200D、L200F和K112V三个突变体,进行了酶学性质表征。其中突变体L200D和L200F的最适反应温度比野生型降低了2℃。其他性质没有显著变化,但通过结果可以看到无论是野生型还是突变型具有良好的热稳定性,同时对金属离子和有机溶剂具有良好的抗性。 4.通过电转化法,将构建的含L200D突变的穿梭表达载体pZ-HSDL200D转入北京棒杆菌。对重组的北京棒杆菌进行发酵,L200D突变后蛋氨酸产量提高了4倍左右。

关键词：高丝氨酸脱氢酶定点突变酶学表征电转化

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

板栗低温糖化研究与多酚氧化酶的纯化表征

板栗低温糖化研究与多酚氧化酶的纯化表征

作者：贾如齐华中农业大学

学位级别：硕士

板栗(Castanea mollisima BL.)是山毛榉科栗属的植物,在我国有着悠久的种植历史。板栗味道可口,富含营养,不仅可炒食,还作为菜肴配料,深受人们喜爱。板栗采后,通常在冷库中进行大量储藏,由于储藏时间长,在储藏过程中板栗的营养品质、微... 详细信息

板栗(Castanea mollisima BL.)是山毛榉科栗属的植物,在我国有着悠久的种植历史。板栗味道可口,富含营养,不仅可炒食,还作为菜肴配料,深受人们喜爱。板栗采后,通常在冷库中进行大量储藏,由于储藏时间长,在储藏过程中板栗的营养品质、微观结构和生理状态以及分子层面都有所改变。本研究即从贮藏前后板栗的变化入手,分析刚采摘不久的新鲜板栗和在冷库中贮藏一年的陈年板栗的品质变化,探究贮藏过程中主要变化的低温糖化过程,对板栗多酚氧化酶(Polyphenol oxidas,PPO)进行纯化和酶学表征,主要研究结果如下:(1)板栗贮藏前后品质分析:营养指标分析表明,陈年板栗对比于新鲜板栗还原糖和可溶性糖含量显著上升,淀粉含量下降,而蛋白、黄酮和多酚等指标没有显著变化。生理指标分析表明,陈年板栗的呼吸速率下降,含水量下降,色泽变白,新鲜板栗和陈年板栗发芽情况无明显差距。感官评定结果表明,陈年板栗糖炒后,香气与甜味较好,外观变差,色泽明显褐变。微观结构观察发现,贮藏后板栗细胞变大,淀粉体减少。另外对贮藏前后板栗进行转录组数据分析,发现贮藏前后板栗分子层面差异显著,在苯丙烷类物质合成,植物激素信号传导,MAPK信号传导等途径中有显著差异,尤其在淀粉和蔗糖代谢途径中,差异基因数量显著。(2)板栗低温糖化机理分析:分别于板栗开始贮藏时(2021年10月1日),板栗糖化进行中(2021年11月25日)和糖化完成阶段(2022年1月3日)取样,进行转录组测序和相关指标分析。结果发现,板栗支链淀粉、蔗糖、果糖和葡萄糖含量先升高后略微降低,直链淀粉和麦芽糖含量一直升高。α-淀粉酶活性降低,β-淀粉酶活性先是不变后增加,蔗糖合成酶活性先降低后升高,酸性转化酶活性先升高后降低。对转录组数据分析,发现淀粉合成酶、淀粉磷酸化酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、异淀粉酶、蔗糖合成酶、蔗糖磷酸酶、酸性转化酶以及4-α-葡聚糖转移酶和水通道蛋白等共同作用参与了糖化过程,并在其中起着重要作用。(3)板栗PPO的纯化鉴定和表征:板栗PPO粗酶液经硫酸铵分级沉淀,DEAE Sepharose FF阴离子交换层析和Sephacryl S-100凝胶柱层析,成功得到纯化了25倍的目的蛋白。经Native-PAGE和SDS-PAGE检测其表观分子量为108KDa,单体分子量为27 KDa,是一个四倍体结构。经质谱结果鉴定为一种新型蛋白A0A8J4VKD7,再通过构建p ET28a载体导入大肠杆菌中表达后验证,发现其具有PPO活性。对板栗PPO进行酶学表征,结果发现,板栗PPO的最适温度和p H值分别为45℃和6.0,且在中性环境与较低温度下保持稳定;板栗PPO对焦性没食子酸和儿茶酚表现出底物亲和,抗坏血酸和柠檬酸对其抑制效果最好。纯化的PPO的活性中心在α-螺旋与β-折叠形成的螺旋束中,其中α-螺旋为37%,β-折叠为37.3%,在327 nm发射波长处有最大的荧光强度1674,证明其色氨酸残基在蛋白内部。

关键词：板栗低温糖化多酚氧化酶转录组学分离纯化酶学表征

芽孢杆菌N1碱性蛋白酶的克隆表达及酶学性质

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

微生物学通报 2019年第4期46卷 685-694页

作者：陈秀娟周成龚劲松史劲松江南大学药学院江苏无锡214122 中国科学院微生物研究所微生物资源前期开发国家重点实验室北京100101

【背景】蛋白酶广泛应用于制革行业中,酶法脱毛对环境污染较小,但蛋白酶对化学试剂的不稳定性及胶原降解活性限制了其工业应用。【目的】克隆芽孢杆菌(Bacillussp.)N1基因组的碱性蛋白酶基因,实现其在大肠杆菌中的异源表达,并对重组酶... 详细信息

【背景】蛋白酶广泛应用于制革行业中,酶法脱毛对环境污染较小,但蛋白酶对化学试剂的不稳定性及胶原降解活性限制了其工业应用。【目的】克隆芽孢杆菌(Bacillussp.)N1基因组的碱性蛋白酶基因,实现其在大肠杆菌中的异源表达,并对重组酶酶学性质及脱毛作用进行研究。【方法】利用基因组文库法克隆获得蛋白酶基因aprG,构建重组大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(DE3)pLysS/pET-28a-aprG。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达该重组酶,以福林酚显色法对其酶学性质进行研究,并将AprG作用于羊皮、兔皮和羽毛。【结果】克隆得到蛋白酶基因aprG,并实现其在大肠杆菌中的表达。重组酶AprG最适反应温度为50°C,最适反应pH为10.0。各种金属离子对AprG活性影响较小,且AprG对表面活性剂和氧化剂、还原剂的耐受性较强。底物特异性分析表明,该酶胶原活性较低。AprG对羊皮和兔皮作用显著,且降解羽毛效果明显。【结论】蛋白酶AprG在制革行业中具有良好的应用前景。

关键词：芽孢杆菌N1 克隆酶学表征低胶原活性脱毛作用

维普期刊数据库

同方期刊数据库评论

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

甜叶菊黄酮糖基转移酶挖掘与功能鉴定

甜叶菊黄酮糖基转移酶挖掘与功能鉴定

作者：郭晨新大连交通大学

学位级别：硕士

甜叶菊因其叶片中含有黄酮类化合物,具有抗肿瘤、抑菌等药理活性。糖基化是黄酮类化合物常见的修饰方式,依赖糖基化转移酶的催化,能够改变黄酮类物质的溶解度、稳定性、生物活性和转运特征等性质,还能够进一步增加黄酮类物质的多样性。... 详细信息

甜叶菊因其叶片中含有黄酮类化合物,具有抗肿瘤、抑菌等药理活性。糖基化是黄酮类化合物常见的修饰方式,依赖糖基化转移酶的催化,能够改变黄酮类物质的溶解度、稳定性、生物活性和转运特征等性质,还能够进一步增加黄酮类物质的多样性。本研究建立在课题组先前转录组数据分析的基础上克隆、表达并表征候选基因,主要研究内容与结果如下:(1)通过提取甜叶菊叶片中RNA,克隆出黄酮糖基转移酶候选基因SrUGT72B1与SrUGT91D2及其突变序列。对克隆出的序列进行比对分析,生物信息学分析表明,SrUGT72B1与SrUGT91D2均具有UDP-糖基转移酶保守结构域,属于糖基转移酶GTB超家族。(2)将SrUGT72B1构建至pET21a载体中,利用大肠杆菌进行异源表达,通过Ni-NTA及阴离子交换纯化得到目的蛋白,利用HPLC法鉴定SrUGT72B1具有糖基化黄酮类化合物的能力。将SrUGT92D1分别构建至p ET21a、p ET21a/p Gro7及p Cold TF载体中,利用大肠杆菌进行异源表达,利用Ni-NTA亲和层析得到目的蛋白利用HPLC法鉴定SrUGT91D2无活性;(3)对SrUGT72B1进行了生化表征实验,SrUGT72B1的最适p H为9.0,最适温度为50℃,SrUGT72B1具有广泛的受体底物耐受性;最适底物为芹菜素;更偏好选择UDP-Glc作为糖供体。分析LC-MS/MS结果,推测该酶能糖基化黄酮类物质的多个羟基位点。鉴定出SrUGT72B1糖基化槲皮素的主要产物为槲皮素3-O-葡萄糖苷。

关键词：甜叶菊糖基化黄酮蛋白表达酶学表征

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

水杨酸脱羧酶的晶体结构及分子改造研究

水杨酸脱羧酶的晶体结构及分子改造研究

作者：程晓涛天津科技大学

学位级别：硕士

一些具有可逆功能的非氧化脱羧酶可在温和的条件下,选择性地将一些酚类物质羧化生成相应的羟基苯甲酸,为一些药物和化工原料的生产提供了新思路。水杨酸是一种结构简单的羟基苯甲酸,是食品,精细化工和医药行业的重要原料和中间体,可用... 详细信息

一些具有可逆功能的非氧化脱羧酶可在温和的条件下,选择性地将一些酚类物质羧化生成相应的羟基苯甲酸,为一些药物和化工原料的生产提供了新思路。水杨酸是一种结构简单的羟基苯甲酸,是食品,精细化工和医药行业的重要原料和中间体,可用于生产乙酰水杨酸（阿司匹林）,然而水杨酸的化学合成工艺复杂,还会产生大量的副产物,因此生物酶法生成水杨酸由于其较强的催化特异性而备受关注。本论文鉴定了丝孢酵母Trichosporon moniliiforme WU-0401来源的水杨酸脱羧酶（Sdc）,该酶可以催化水杨酸脱羧与苯酚相互转化的可逆反应由,将该酶作为研究对象,对其进行了表达、纯化、产物鉴定、酶学表征、结晶化、结构解析、底物选择性分析及分子特异性改造研究,主要研究情况如下。（1）对水杨酸脱羧酶基因（Sdc）进行了克隆及重组载体的构建,实现了其在*** BL21（DE3）中的高效可溶性表达,经镍离子亲和层析和Resource Q阴离子交换层析得到了高纯度的Sdc蛋白（纯度＞97%）。活性检测和产物分析证明了 Sdc具有催化可逆反应由水杨酸脱羧生成苯酚或者由苯酚羧化生成水杨酸的功能,且在催化苯酚的羧化反应时,产物仅有水杨酸,而无间羟基苯甲酸或对羟基苯甲酸生成。酶学性质和酶动力学研究表明Sdc在进行脱羧反应时的最适温度为50℃,最适缓冲液为MES-NaOH（pH 5.5）,进行羧化反应时的最适温度为30℃,最适KHCO3缓冲液浓度为2.5M,最适金属离子Zn2+,最适条件下脱羧反应和羧化反应的Km分别为1.14,81.34 mM,kcat/Km为 3.17,0.011 s-1mM-1。（2）对Sdc进行结晶条件的筛选和优化,其最佳结晶条件为0.1 M HEPES（pH 8.5）、32%PEG400、200mMNaCl,在此基础上进行了 Sdc与水杨酸的共结晶。得到的晶体经X-衍射收集数据后,再经HKL2000和CCP4软件处理和解析,分辨率分别达到了 1.44、1.67 A。Sdc的三维结构是传统的TIM-barrel结构,由15个α螺旋和10个β 折叠组成,底物水杨酸被 Y27、H169、P191、F195、H224、D298、Y301、Zn2+以及相邻蛋白分子的R235、W239包围,此外,活性中心的Zn2+还有3个配体氨基酸,分别是 E8、H169、D298。（3）为了获得催化活性或者催化效率更高的Sdc突变体,通过分析Sdc的三维结构,选取底物结合域附近的氨基酸位点进行理性设计和分子改造。经过筛选后,获得了高性能突变体Y64T,Y64T对水杨酸的脱羧活性较野生型提高了 0.8倍,催化效率提高了 0.82倍,结构分析表明,Y64T突变体扩大了活性中心的内腔;而活性中心Zn2+配位的3个氨基酸中任何一个发生突变后,都会完全丧失活性,说明该配位体结构对其催化活性的发挥至关重要。底物特异性结果表明,Sdc还可催化2,4-二羟基苯甲酸和2,6-二羟基苯甲酸脱羧生成间苯二酚,催化2,3-二羟基苯甲酸脱羧生成邻苯二酚,但不能催化3-羟基苯甲酸、4-羟基苯甲酸、3,4-二羟基苯甲酸、3,5-二羟基苯甲酸的脱羧反应,说明Sdc能够特异性地识别羟基苯甲酸上与羟基相邻的羧基。

关键词：水杨酸脱羧酶酶学表征晶体结构分子改造底物特异性

巨核细胞蛋白质酪氨酸磷酸酶2在骨质疏松模型大鼠中的表达水平研究

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

巨核细胞蛋白质酪氨酸磷酸酶2在骨质疏松模型大鼠中的表达水平研究

作者：王丰吉林大学

学位级别：硕士

巨核细胞酪氨酸磷酸酶2 ( Megakaryocyte Protein Tyrosine Phosphatase2,PTP-MEG2)在红系细胞发育、机体炎症反应和胰岛素等信号转导过程中起着关键的调控作用,与人类的疾病密切相关。本论文克隆了PTP-MEG2的催化结构域△PTP-MEG2基因... 详细信息

巨核细胞酪氨酸磷酸酶2 ( Megakaryocyte Protein Tyrosine Phosphatase2,PTP-MEG2)在红系细胞发育、机体炎症反应和胰岛素等信号转导过程中起着关键的调控作用,与人类的疾病密切相关。本论文克隆了PTP-MEG2的催化结构域△PTP-MEG2基因,通过可溶性表达得到△PTP-MEG2,并对其进行了酶学性质表征及△PTP-MEG2多克隆抗体的制备;应用制备的抗体对骨质疏松症大鼠的多种组织及骨髓细胞、红细胞和骨髓基质细胞(BMSCs)进行了Western blot分析,发现PTP-MEG2在大鼠的多种组织中均有不同程度的表达,并且在骨质疏松症大鼠的肾脏组织中表达水平升高,而在肌肉组织中却出现了一定程度的下降,说明PTP-MEG2可能与肌肉活动和肾功能有关,同时发现PTP-MEG2在骨质疏松症大鼠的骨髓细胞中表达量增加。本研究分析了骨质疏松症与PTP-MEG2的相关性,为揭示PTP-MEG2在骨质疏松症发展过程中的调控作用提供了理论依据,也为进一步了解PTP-MEG2在人类疾病中的病理和生理功能奠定了基础。

关键词： PTP-MEG2 酶学表征抗体制备骨质疏松模型