利用有机小分子研究Bim调控Hsp70分子伴侣功能

作     者：潘皓 

作者单位：大连理工大学 

学位级别：硕士

导师姓名：张志超

授予年度：2021年

学科分类：0710[理学-生物学] 071010[理学-生物化学与分子生物学] 07[理学] 

主      题：Hsp70蛋白 Bim 酵母 小分子抑制剂 

摘      要：蛋白质稳态是细胞能够正常发挥基本细胞功能所必须的,分子伴侣蛋白是蛋白质稳态的重要调控者,70 k Da的热休克蛋白（Hsp70）是细胞中普遍存在的分子伴侣之一。从原核生物到真核生物,Hsp70在广泛的细胞基本功能调节过程中发挥重要的作用,例如新合成蛋白的折叠,多肽进入线粒体、叶绿体和内质网,蛋白质复合物的分解和蛋白质活性的调节。Hsp70的分子伴侣功能需要辅伴侣蛋白的调控来完成。Hsp70拥有众多的辅伴侣蛋白,包含J protein家族蛋白和NEF家族蛋白。本课题组首次报道了BH3-only蛋白Bim能够作为Hsp70的辅伴侣蛋白。Bim通过BH3结构域与Hsp70结合,稳定Hsp70的ATP构像,提高了Hsp70的ATPase活性。一直以来,Bim被认为是凋亡激活因子:一方面Bim可以直接激活Bcl-2促凋亡成员Bax/Bak,另一方面还能拮抗抗凋亡的Bcl-2/Mcl-1蛋白。因此在哺乳动物细胞中,Bim通过调控Hsp70促进细胞生存的这一功能受到Bcl-2家族蛋白的干扰导致研究比较困难。酵母中没有Bcl-2家族同源蛋白,Bim可以在酵母中外源表达并且保持活性,又不能发挥其促凋亡功能,因此酿酒酵母是非常适合研究Bim的促生存功能的简单模型。另外,小分子具有结构简单,功能清晰,靶标单一等优点,是研究蛋白质功能的理想工具。本课题组已经研发的第一个Hsp70/Bim的小分子抑制剂S1g-6（2-（6-环己基硫基-2-氰基-1-氧-1H-非那烯基氨基）乙基吗啉）,能够直接地、特异性地结合在Bim在Hsp70表面的结合位点,是研究Bim作为辅助伴侣蛋白调控Hsp70功能的分子工具。本论文首先表达纯化重组的Hsc70蛋白和J protein蛋白用于体外研究Bim对Hsp70的调控,通过酶活实验以及底物热变性实验,证明了Bim在体外正向调控Hsp70的分子伴侣功能,通过刺激Hsp70的ATPase活性来发挥辅伴侣功能。之后,将Bim转化的酵母菌株在S1g-6处理下,通过检测酵母的生长曲线,从酵母生长表型上初步证明了外源蛋白Bim的转入促进了酵母的生长,而S1g-6抑制了酵母的生长。免疫共沉淀Hsp70,Western blot检测Hsp70和Bim的蛋白-蛋白相互作用,证明了Bim通过结合酵母中Hsp70促进了酵母的生长,而S1g-6通过解离这一相互作用抑制酵母的生长。在热应激处理条件下,通过检测酵母生长曲线、Western blot检测Hsp70和底物蛋白的蛋白-蛋白相互作用,证明了Bim提高了酵母的耐热能力及热应激恢复能力。证实了Bim在酵母中发挥正向的辅伴侣作用,促进了Hsp70的分子伴侣功能,展现了Bim的促生存功能。另外,通过串联质谱标签技术（TMT技术）鉴定一系列Bim调控的Hsp70的互作蛋白以及通过S1g-6解离Hsp70/Bim二聚体所调控的Hsp70的互作蛋白,将差异蛋白进行GO富集分析,进一步证实了Bim通过正向调控酵母中Hsp70的功能来促进酵母的生长,在一定程度上揭示了Bim的促生存功能。综上所述,本论文证明了一定浓度的Bim在体外不同温度条件下对Hsp70分子伴侣功能的正向调控作用,以及在无Bcl-2家族蛋白干扰的酵母细胞中证明了Bim的促生存功能,为进一步在哺乳动物细胞中研究Bim这一新的Hsp70辅伴侣蛋白提供了研究方向。