EGFR基因突变对恶性胶质瘤GLUT3表达的调控作用
作者单位：海南医学院
学位级别：硕士
导师姓名：杨堃
授予年度：2019年
学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学]
摘 要：研究背景:恶性胶质瘤是一种具有侵袭性及异质性等特性的颅内原发恶性肿瘤,其发病率大约为5-8/10万（1）。目前所有现行治疗手段均不能很好的改善患者的预后,因此迫切需要寻找新的治疗手段来靶向或者免疫治疗胶质瘤从而使患者获益。近年来肿瘤能量代谢异常越来越受到重视,“Warburg effect效应也凸显了其在肿瘤十大特征中独道的一面。有氧糖酵解是肿瘤的重要特征,充分的葡萄糖供给是实现肿瘤能量平衡的关键。葡萄糖转运酶3（GLUT3）是脑组织中含量最多且转运速率最快的葡萄糖转运酶,前期已有文献报道其在胶质瘤的恶性发生发展过程中起到了重要作用并与胶质瘤的级别呈一定关系（11-13）。然而其具体作用机制却尚不明了。表皮生长因子受体（EGFR）在高达50%的GBM中被扩增和/或突变,通过持续激活信号网络和代谢重编程促进肿瘤生长和存活,目前有关EGFR与GLUT3在胶质瘤中的关系鲜有研究,本课题拟通过一系列体内外实验来证实两者是通过何种机制来影响胶质瘤的生物学行为,从而为胶质瘤的治疗提供理论依据。目的:（1）明确EGFR与GLUT3在恶性胶质瘤细胞及组织中的表达及其相关性。（2）探讨胶质瘤中EGFR调控GLUT3表达的机制。（3）探明GLUT3基因沉默对胶质瘤细胞增殖的影响。方法:（1）采用蛋白质免疫印迹法（western-blot）检测EGFR、P-EGFR、GLUT3三者在U87、LN229及其过表达EGFR的胶质瘤细胞株中的蛋白表达量。再用酪氨酸激酶抑制剂TKIs（1ul）加入细胞培养基中共培养24小时后,检测上述三者的蛋白含量,进一步验明从而了解EGFR与GLUT3的相关性。（2）运用Rembrandt、TCGA、GEO等肿瘤数据库进行检索,进一步分析恶性胶质瘤中EGFR与GLUT3的相关性,并探讨二者对胶质瘤患者的生存预后的影响。（3）采用赛默飞世尔（https://***/）在线引物设计软件设计GLUT3靶基因干扰引物序列,运用载体构建的基本方法（退火,酶切,挑单克隆,质粒抽提,测序等）构建其干扰质粒,转染细胞并筛选后运用Western-blot检测GLUT3基因沉默效率。选取效率较高（大于70%）的慢病毒留作后续实验。（4）购买免疫缺陷型小鼠30只,并平均随机分为3组。饲养约7天后进行颅内原位注射已感染sh-GLUT3的U87Ⅷ细胞,空白组注射sh的空载体。构建裸鼠颅内原位模型并饲养于SPF级别的动物实验室,定期观测小鼠生长情况（精神、饮食、活动情况等）,待小鼠出现症状后（约30天）处死裸鼠获取肿瘤。组织切片后H＆E伊红染色观察肿瘤形态,免疫组化检测肿瘤增殖细胞核抗原Ki-67指数。（5）通过沉默胶质瘤细胞SOX9基因,检测胶质瘤细胞GLUT3的蛋白表达量（Western-blot 法）。运用生物信息学软件JASPAR（http://***/）明确SOX9与GLUT3的启动子结合位点;构建GLUT3启动子;并将其与过表达的SOX9质粒共转染细胞,行双荧光素酶报告基因法于酶标仪上检测并分析数据。（6）运用收集到的临床胶质瘤组织标本,免疫组化检测EGFR与GLUT3的表达量,结合临床分析两者对患者的生存曲线的影响。结果:（1）Western-blot检测发现过表达EGFR后GLUT3的表达呈上升趋势,运用TKIs抑制药物GLUT3表达量减少,两者呈现正相关趋势。（2）肿瘤数据库Rembrandt227例临床样本发现EGFR与GLUT3呈正相关,且两者高表达较低表达生存期缩短,结果具有统计学意义。（3）Western-blot检测GLUT3基因表达下调可达75%,GLUT3慢病毒表达载体 pLVX-shRNA-GLUT3 构建成功。（4）细胞增殖实验、克隆形成实验显示下调GLUT3后U87Ⅷ、LN229Ⅷ细胞增殖能力下降。H＆E检测实验组、空白对照组裸鼠原位接种成功,GLUT3基因沉默能有效抑制胶质瘤在裸鼠颅内生长,结果具有统计学意义。（5）双荧光素酶报告基因显示SOX9可以直接与GLUT3启动子特异性结合。且敲减SO9后GLUT3蛋白的表达量也显著降低,结果具有统计学意义。（6）收集到的临床胶质瘤样本显示P-EGFR,GLUT3的共表达与胶质瘤的不良预后相关,结果具有统计学意义。结论:（1）EGFR的突变或扩增可引起GLUT3蛋白的升高,两者呈显著正相关,GLUT3的下降可引起细胞增殖及成瘤能力的下降。（2）EGFR可以通过转录因子SOX9来调控GLUT3的变化从而来调节胶质瘤的生物学行为。（3）EGFR与GLUT3的共表达与患者不良预后有关。
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