TRPM2—GSK-3β—NF-κB—IL-1β信号调控在难治性癫痫中的作用及其机制研究

作     者：马梦宇 

作者单位：山东大学 

学位级别：硕士

导师姓名：孔庆霞

授予年度：2021年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100204[医学-神经病学] 10[医学] 

主      题：难治性癫痫 瞬时受体电位M型2通道 糖原合酶激酶-3 白细胞介素-1β N-(对戊基肉桂酰)邻氨基苯甲酸 

摘      要：研究背景癫痫（Epilepsy,EP）被定义为大脑中导致短暂临床症状或体征的异常同步神经元活动,常伴随病耻感和共患情感障碍等疾病。近几十年来,专家学者通过开发新型抗癫痫药物（Antiepileptic drugs,AEDs）和发展外科手术技术,解决了部分耐药性癫痫（Intractable epilepsy,IE）的负担。但是IE患者的百分比并没有发生实质的变化。癫痫的发病机制非常复杂,主要有家族遗传、颅脑损伤、感染、代谢及免疫等。瞬时受体电位M 型 2 通道（Transient receptor potential melastatin type 2 channel,TRPM2）是Ca2+可渗透的非选择性阳离子通道,在脑内广泛表达。TRPM2通道通过介导氧化应激和炎症反应参与多种中枢神经系统疾病的发展,包括创伤性脑损伤（Traumatic brain injury,TBI）、阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）等的潜在治疗靶点。在双相情感障碍（Bipolar disorder,BP）中,利用TRPM2敲除小鼠观察到,小鼠体内糖原合酶激酶-3（Glycogen synthase kinase-3,GSK-3）的活性丧失。在缺氧缺血性脑损伤中,阻断TRPM2通道后能够增加神经保护作用,减少缺氧缺血带来的脑损伤,而这种作用是通过调节GSK-3β来实现的。由此可以得出GSK-3β的磷酸化依赖TRPM2通道,但具体机制尚不清楚,特别在癫痫中未发现相关报道。研究表明,TRPM2可以被多种因素激活或抑制,其中N-（对戊基肉桂酰）邻氨基苯甲酸（N-（p-amylcinnamoyl）Anthranilic Acid,ACA）是一种广谱 TRP 通道阻断剂。基于以上,我们猜想,TRPM2作为一种非选择性阳离子通道,在癫痫发作后,TRPM2通道被激活,引起钙离子内流,激活钙调神经磷酸酶,从而激活GSK-3β,激活核因子-κB（Nuclear factor kappa-B,NF-κB）诱发炎性反应,从而促进白细胞介素-1β（Interleukin 1β,IL-1β）的释放,引起癫痫。我们试着以TRPM2-GSK-3β—NF-κB—IL-1β为主线探讨其在癫痫中的作用机制,为癫痫的治疗寻找一种新的思路。研究目的通过检测颞叶癫痫患者脑组织和慢性颞叶癫痫动物模型海马组织中的TRPM2、GSK-3β、NF-κB及IL-1β表达情况,探究TRPM2通道介导的GSK-3β诱导炎症反应的作用机制,论证对TRPM2施加干预后对难治性癫痫的治疗作用。研究方法1.收集10例行颞叶皮质切除的难治性癫痫患者的脑组织为癫痫组,10例行颅内减压切除颞叶皮质的颅脑外伤患者的脑组织为对照组。应用荧光定量PCR和蛋白免疫印迹的方法研究TRPM2、GSK-3β、NF-κB、IL-1β在颞叶皮质中的表达情况。2.实验大鼠分组:癫痫模型组（E组,n=18）,即首先腹腔注射LiCl,18-24h后注射PILO进行癫痫造模;ACA干预组（E+A组,n=18）,即造模成功4h后腹腔注射ACA;对照组（C组,n=20）,即腹腔注射造模组同等剂量的生理盐水。应用荧光定量PCR、蛋白免疫印迹的方法研究TRPM2、GSK-3β、NF-κB、IL-1β在大鼠海马组织中的表达变化,应用免疫组化、免疫荧光的方法检测大鼠脑组织切片中TRPM2、GSK-3β的表达情况。研究结果1.注射LiCI-PILO后,有36只颞叶癫痫模型大鼠存活。造模成功率为90%。造模成功后注射ACA组及生理盐水组无死亡。2.荧光定量PCR结果显示,癫痫组患者脑组织中TRPM2（p0.01）、GSK-3β（p0.01）、NF-κB p65（p0.001）、IL-1β（p0.01）的水平高于对照组。E 组大鼠海马组织中 TRPM2（p0.001）、GSK-3β（p0.001）、NF-κB p65（p0.01）、IL-1β（p0.001）的水平高于C组,而E+A组大鼠海马组织中TRPM2（p0.001）、GSK-3β（p0.05）、NF-κB p65（p0.001）、IL-1β（p0.001）的水平低于E组。3.蛋白免疫印记结果显示,癫痫组患者脑组织中TRPM2（p0.01）、GSK-3β（p0.01）、GSK-3β（Y216）/GSK-3β（p0.05）、NF-κB p65（p0.01）、IL-1β（p0.05）的表达水平高于对照组,而癫痫组患者脑组织中GSK-3β（S9）/GSK-3β（p0.05）的表达水平低于对照组。E组大鼠海马组织中TRPM2（p0.01）、GSK-3β（p0.05）、GSK-3β（Y216）/GSK-3β（p0.05）、NF-κBp65（p0.01