胆固醇-25-羟化酶和厚朴酚对猪流行性腹泻病毒复制的影响

作     者：张云航 

作者单位：南京农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王先炜

授予年度：2019年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：猪流行性腹泻病毒 胆固醇25羟化酶 25羟化胆固醇 厚朴酚 

摘      要：猪流行性腹泻病毒（PEDV）是一种单股正链RNA病毒,冠状病毒科的成员。PEDV基因组全长约28kb,由5’UTR,3’UTR和七个开放阅读框（ORFs）组成,ORFs编码两个多蛋白（pp1a和pp1b）、S蛋白、N蛋白、E蛋白、ORF3和M蛋白。PEDV首先侵入猪的小肠上皮细胞,致使猪发生急性水样腹泻,脱水,厌食和呕吐。胆固醇25羟化酶（CH25H）是宿主限制性因子,通过其酶活性将胆固醇羟化形成25羟化胆固醇（25HC）。本研究通过表达和干扰CH25H来进一步证明了 CH25H对PEDV的复制有明显的抑制作用,之后研究了其具体的作用机理。厚朴酚（magnolol）是一种天然药物的提取物,本研究通过在Vero细胞上的实验,验证了其对PEDV有明显的抑制作用。1、CH25H抑制PEDV复制的机制研究在研究中发现PEDV感染的Vero细胞中CH25H的mRNA水平随着接毒时间的延长而明显下降,用IFN-α刺激Vero细胞,CH25H的mRNA水平并无显著地变化,说明其在Vero细胞上并非是干扰素刺激基因。为了研究在Vero细胞中CH25H对PEDV复制的影响,通过转染真核表达质粒和小干扰RNA干扰的方法,证明了 CH25H可显著抑制PEDV的复制,同时我们也发现CH25H的酶活性产物25HC也具有显著的抗PEDV的作用,并且呈现剂量依赖性的关系。为了探究25HC影响病毒入侵的具体环节,通过qRT-PCR的方法检验25HC对病毒的吸附、入胞、复制、释放过程的影响,结果证明25HC能够显著抑制病毒入胞的过程。同时,研究也发现25HC对PEDV具有广谱的抗病毒作用,其对经典毒株（CV777）,缺失毒株（PEDVSH）和流行毒株（PEDVMS和PEDVYZ）均存在抑制作用。为了检验酶活性是否会影响CH25H的抗病毒活性,通过点突变的方法构建缺失酶活性CH25H突变体质粒（CH25H-M）,即不能产生25HC,过表达结果表明CH25H-M仍然能够抑制PEDV的复制。为了进一步探究CH25H的抗病毒机制,通过蛋白质谱的方法寻找到了关键蛋白Dermcidin（DCD）,并且过表达DCD可以促进PEDV的感染。然而,共转CH25H和DCD时,我们惊奇的发现CH25H可以以剂量依赖性的方式降解DCD,并且不依赖于CH25H的酶活性。为了研究CH25H是通过何种途径降解DCD的,研究中选择了蛋白酶体抑制剂,凋亡途径抑制剂和自噬溶酶体途径抑制剂,结果显示CH25H可通过自噬溶酶体途径降解DCD。最后,在ST细胞探究了 CH25H及25HC对与PEDV同科的另一种猪冠状病毒-猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）的影响,结果表明CH25H和25HC对TGEV的感染也存在抑制作用。本研究首次揭示宿主限制因子CH25H对PEDV感染的抑制作用,并解析了相关机制。2、Magnolol对PEDV在Vero细胞中复制的作用首先进行FDA-Approved药库中的88种药在Vero细胞上对PEDV影响的筛选。通过第一步筛选出对PEDV有抑制作用的三种药物,分别为Magnolol、（+）-Usniacin 和 Parthenolide。首先用 CCK-8 测定了 Magnolol 和（+）-Usniacin 在浓度30 μM以下对Vero细胞并无毒性作用,然后采用剂量依赖法来测定了 Magnolol对PEDV的抑制作用,通过Western blotting、qRT-PCR、等方法测定出随着Magnolol的剂量增加,对PEDV的抑制效果也越来越明显。为了研究Magnolol是否对PEDV具有广谱的抗病毒作用,选用PEDV毒株包括经典株（CV777）,缺失株（PEDV SH）和变异株（PEDV MS和PEDV YZ）,实验结果表明Magnolol对四种毒株均存在抑制作用。Magnolol在病毒感染过程中,明显阻抑其复制过程。本研究首次揭示了天然提取物Magnolol可抑制PEDV复制,为以后PEDV的防治上提供了新的视野。