卵形鲳鲹NF-κB家族基因克隆与表达分析

作     者：段家文 

作者单位：广西大学 

学位级别：硕士

导师姓名：韦友传

授予年度：2020年

学科分类：0908[农学-水产] 09[农学] 

主      题：卵形鲳鲹 NF-κB 表达分析 蛋白表达与纯化 多克隆抗体 

摘      要：核因子-κB（nuclear factor-kappa B,NF-κB）蛋白包括NF-κB1、NF-κB2、Rel A、Rel B和c-Rel,以二聚体的形式构成转录调控因子,能够结合靶基因的NF-κB结合位点,调控靶基因的表达,参与机体的免疫应答、细胞凋亡、癌症等多种生物学过程。卵形鲳鲹（Trachinotus ovatus）已成为我国南方重要的经济养殖鱼类,每年由于病害给卵形鲳鲹养殖业造成巨大经济损失。鉴定卵形鲳鲹免疫相关分子,解析其结构与免疫反应规律,将为制定新的免疫和病害防控策略提供科学参考。鉴于NF-κB信号通路在机体中的重要作用,本研究克隆鉴定了卵形鲳鲹NF-κB（Tro NF-κB）家族基因;分析其在正常组织中的表达分布以及在刺激后的表达变化规律;最后完成TroRelB重组蛋白的表达纯化与其多克隆抗的制备。现将主要研究结果归纳如下:1、采用RT-PCR和RACE等分子生物学技术,获得Tro NF-κB家族基因（Tro NF-κB1、Tro NF-κB2、Tro Rel A、TroRelB和Troc-Rel）的全长c DNA分别为4215 bp、3836 bp、3167 bp、2781 bp和3501 bp;ORF长度分别为2826 bp、2715 bp、1866 bp、1728 bp和1947 bp;分别编码941、904、621、575和648个氨基酸。Tro NF-κB家族5个蛋白均含有1个RHD结构域和1个IPT结构域,而Tro NF-κB1和Tro NF-κB2均存在DD结构域和ANK结构域。同源性分析结果显示,Tro NF-κB1、Tro NF-κB2、Tro Rel A、TroRelB和Troc-Rel蛋白与鱼类的同源性较高,分别为81.2-88.4%、83.8-95.1%、86.0-93.5%、62.3-87.3%和83.5-91.2%。进化树分析结果表明,上述5个蛋白分别与其他鱼类聚为一支,表明其亲缘关系较近。综上所述,Tro NF-κB家族基因在进化过程中相对保守,并推断其对应的功能也相对保守。2、应用qPCR检测NF-κB家族基因在健康卵形鲳鲹心脏、肝脏、脾脏、头肾、皮肤、脑、鳃、胃、肠和肌肉等组织的表达分布,结果表明,Tro NF-κB家族基因在所检组织中均有表达,呈组成型分布,表明其参与基础的生命活动。这些基因在不同组织中的表达丰度并不相同,其中,Tro NF-κB1、TroRelB和Troc-Rel均在脾脏组织中表达最高;Tro NF-κB2和Tro Rel A在肝脏中表达最高;它们均在皮肤组织中表达最低。上述5个基因在免疫相关组织中的表达较高,暗示Tro NF-κB家族基因参与先天免疫反应的调控。3、LPS、poly I:C和溶藻弧菌刺激后,Tro NF-κB家族5个基因在肌肉组织中的表达变化不显著,在肝脏、脾脏和头肾中表达均显著上调（P0.05）,具体表达变化如下:（1）LPS刺激后,肝脏中Tro NF-κB1的表达水平在12 h和24 h显著上调,脾脏和头肾中的表达量在刺激6 h和12 h显著上调;所检组织中Tro Rel A的表达上调显著的时间点与Tro NF-κB1类似,不同的是头肾中Tro Rel A的表达量在刺激后12 h不显著上调;肝脏、脾脏和头肾中Tro NF-κB2、TroRelB和Troc-Rel的表达在刺激后12 h均显著上调,头肾和肝脏中Tro NF-κB2的表达分别在6 h和24 h显著上调至峰值;头肾和脾脏中Troc-Rel的表达量分别在刺激后6 h和24 h达到峰值;TroRelB的表达情况与Troc-Rel类似,不同点是头肾中的表达量在刺激24 h显著上调。（2）poly I:C刺激后,脾脏和肝脏中Tro NF-κB1的表达量分别在刺激后6 h和12 h达到峰值,头肾中的表达在6 h逐渐上调至24 h达到最高水平;肝脏和脾脏中Tro NF-κB2的表达量在刺激后6 h显著上调至12 h到达最大值,头肾中的表达量在12 h达到峰值;Tro Rel A的表达模式与Tro NF-κB2类似,不同点是头肾中其表达在刺激6 h和24 h显著上调;肝脏和头肾中TroRelB的表达水平在刺激12 h达到峰值,而脾脏的表达量在6 h快速升至峰值,随后在12 h下降又在24 h显著上升;Troc-Rel在肝脏、脾脏和头肾中的表达均在刺激后24 h显著上调,肝脏中的表达量在48 h时达到峰值。（3）感染溶藻弧菌后,肝脏中Tro NF-κB1的表达水平在刺激后6 h到达峰值,肝脏、脾脏和头肾组织中的表达在刺激后12 h和24 h均显著上调;头肾、肝脏和脾脏中Tro NF-κB2的表达分别在刺激后6 h、24 h和24 h达到最高水平,肝脏和头肾中其表达在12 h显著上调;肝脏、脾脏和头肾中Tro Rel A的表达量分别在刺激后24 h、12 h和48 h显著上调至峰值;TroRelB的表达谱与Tro NF-κB2类似,不同点在于肝脏中的表达在刺激后24 h无上调现象;脾脏、头肾和肝脏中Troc-Rel的表达量分别在刺激后6 h、12 h和24 h显著上调,并分别在递进的下一时间点上调至峰值。研究表明,Tro NF-κB基因在调控抵御病原微生物入侵的免疫反应中发挥关键作用。4、成功构建p ET-32a-Rel B表达载体,并在E.coli BL21中诱导表达,获得TroRelB重组蛋白的相对分子质量为84 k Da。Western blot检测显示在84 k Da处出现明显条带,表明TroRelB重组蛋白能被抗His标签抗体识别;纯化的重组蛋白免疫小鼠获得抗TroRelB血清,ELISA测定其效价为1:256000,Western blot检测该抗体可特异性结合TroRelB重组蛋白。TroRelB重组蛋白的纯化及其多抗的制备为深入研究TroRelB结构及功能奠定基础。