MTH1小分子抑制剂诱发癌细胞DNA损伤反应并抑制癌细胞存活的研究

作     者：侯跃芳 

作者单位：吉林大学 

学位级别：硕士

导师姓名：邹志华

授予年度：2020年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：活性氧 MTH1 小分子抑制剂 肿瘤 

摘      要：活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)是保证生命活动得以正常进行的一类极其重要的分子。然而,过量的ROS会导致细胞内生物大分子例如核酸分子被氧化,从而对细胞产生极为不利的影响。在细胞中,核苷酸池中的游离核苷酸尤其是三磷酸鸟苷酸(dGTP)比DNA更容易受到ROS的影响而发生氧化损伤。被氧化的三磷酸鸟嘌呤核苷酸(8-oxo-dGTP)等掺入到DNA中会导致错配、突变甚至细胞死亡。MTH1(MutT homology 1)作为一种焦磷酸酶,能够高效降解核苷酸池中被氧化的游离核苷酸如8-oxo-dGTP等,从而减轻高水平ROS对增殖细胞带来的致命损伤。有研究显示,肿瘤细胞由于生长和代谢异于正常细胞,导致其ROS水平显著高于正常细胞,从而使其更加依赖于MTH1的保护作用。既然MTH1对癌细胞的生存具有举足轻重的地位,那么抑制MTH1的活性对癌细胞而言将是一个沉重的打击。因此,研发新型、高效的MTH1抑制剂为癌症的治疗提供了新的策略。在前期研究中,我们实验室合成并筛选到一批潜在的新型MTH1抑制剂。在酶学水平上,我们已经证明这些小分子化合物均具有极强的MTH1抑制活性。但是,它们是否能在细胞内与MTH1蛋白结合并抑制其活性,进而对癌细胞造成致命打击尚有待研究。在此前提下,本次研究深入探究了这些潜在的新型MTH1抑制剂对癌细胞内MTH1活性以及细胞增殖的影响。首先,我们利用细胞热位移测定试验(Cellular Thermal Shift Assay,CETSA)检测了小分子化合物与靶标蛋白MTH1的结合效率。CETSA结果显示,前期实验筛选到的潜在新型MTH1抑制剂均在一定程度上与细胞内的MTH1蛋白紧密结合。其次,我们进一步探究了与细胞内MTH1结合较强的两个化合物C72-125和501513对细胞中MTH1活性的影响。我们提出假设:如果C72-125和501513能够抑制MCF-7乳腺癌细胞中MTH1的活性,那么MCF-7细胞的核苷酸池中的游离8-oxo-dGTP就无法得到有效地清除,因此就会有更多的8-oxo-dGTP掺入到DNA中,从而导致细胞中氧化鸟嘌呤核苷(8-oxo-G)的含量升高。8-oxo-G免疫荧光染色显示,14μM的C72-125和1.6μM的501513处理6小时后,MCF-7乳腺癌细胞中8-oxo-G的含量显著升高。8-oxo-G流式细胞术显示出同样的结果。再次,掺入到DNA中的8-oxo-G通常会被碱基切除修复(Base Excision Repair,BER)通路识别并修复,而该过程会导致DNA单链断裂,甚至会造成DNA双链断裂。于是,我们猜想,既然C72-125和501513处理后细胞中8-oxo-G的含量显著升高,那么C72-125和501513处理后细胞中DNA断裂的水平应该也会升高。碱性彗星实验结果表明,7μM或14μM的C72-125和0.8μM或1.6μM的501513处理24小时后MCF-7乳腺癌细胞的尾矩显著增加,说明C72-125和501513处理后MCF-7乳腺癌细胞中DNA断裂显著增加。此外,C72-125和501513处理6小时后的53BP1免疫荧光染色显示,药物处理后53BP1染色灶(foci)阳性的MCF-7乳腺癌细胞的比例显著增加,这同样揭示了C72-125和501513引起MCF-7乳腺癌细胞中产生大量DNA损伤。最后,我们检测了C72-125和501513对癌细胞生存的影响。MTT和集落形成实验结果表明,C72-125和501513会抑制MCF-7细胞的增殖,并且药物浓度越高对细胞增殖的抑制越明显,药物的浓度与其对细胞增殖的抑制作用呈现剂量依赖的关系。MTT数据分析表明,当C72-125处理MCF-7细胞24小时时,IC为47.22μM;当C72-125处理MCF-7细胞48小时时,IC为14.33μM;当C72-125处理MCF-7细胞72小时时,IC为8.314μM。MTT数据还显示,当501513处理MCF-7细胞24小时时,IC为13.06μM;当501513处理MCF-7细胞48小时时,IC为1.58μM;当501513处理MCF-7细胞72小时时,IC为1.239μM。此外,MTT实验结果还表明,C72-125和501513对正常细胞的毒性显著低于其对MCF-7乳腺癌细胞的毒性。细胞周期检测结果显示,用7μM的C72-125处理MCF-7细胞24小时后,细胞周期被阻滞在G/M期;用1.6μM的501513处理MCF-7细胞24小时后,细胞周期被阻滞在G期。细胞凋亡检测结果显示,C72-125和501513处理后凋亡细胞所占比例明显增加,说明C72-125和501513诱导MCF-7细胞发生凋亡。综上所述,前期实验筛选到的潜在新型MTH1抑