注射用丹参多酚酸盐对肝纤维化大鼠的保护作用及机制研究

作     者：许琪华 

作者单位：广州中医药大学 

学位级别：硕士

导师姓名：谭行华

授予年度：2020年

学科分类：1008[医学-中药学(可授医学、理学学位)] 1006[医学-中西医结合] 100602[医学-中西医结合临床] 10[医学] 

主      题：注射用丹参多酚酸盐 肝纤维化 炎症因子 凋亡 

摘      要：目的:肝纤维化是多种慢性肝病所致的一种可逆的纤维性瘢痕,主要表现为肝组织内细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的过度增生与沉积,导致肝脏组织结构的异常改变。注射用丹参多酚酸盐(Salvianolatelyophilized injection,SLI)是以三级指纹图谱从单味中药丹参中提取的以丹参乙酸镁(magnesium lithospermate B,MLB)为主要成分的盐类化合物,具有抗炎、抗氧化、保肝护肝的药理作用。目前SLI在肝纤维化的保护作用及机制研究尚少见。本实验研究旨在探索SLI对肝纤维化大鼠的保护作用并在人肝星状细胞LX-2上探讨相关分子机制。方法:1.模型构建及药物干预将72只SD大鼠按体重以随机区间分组法分为正常组、模型组、秋水仙碱组(0.12 mg/kg)、SLI 高剂量组(50 mg/kg)、SLI 中剂量组(25 mg/kg)、SLI 低剂量组(12.5 mg/kg),每组12只,雌雄各半。造模第一天除正常组外其余各组均按照5 ml/kg的比例皮下注射20%CCl4(V/V)花生油混合溶液,其后间隔3天以3 ml/kg体重比例进行皮下注射。造模开始第2天按照3 ml/kg比例对大鼠进行腹腔注射猪血清,此后间隔3天以1 ml/kg比例进行腹腔注射。造模第3周开始,每周注射20%CCl4花生油混合溶液及猪血清各一次直到第十二周。实验过程中正常组给予普通饮食喂养,其余各组均饮用10%乙醇,饲用高脂玉米粉(795 g/kg玉米粉+200 g/kg猪油+5 g/kg胆固醇)。从第5周开始对各实验组进行药物干预,正常组与模型组以同等容积蒸馏水灌胃,秋水仙碱组每日0.12 mg/kg灌胃一次、SLI高中低剂量组以50 mg/kg、25 mg/kg及12.5 mg/kg剂量每日腹腔注射一次,持续8周。2.检测指标实验第13周,经腹主动脉采集血清及提取肝脏。通过HE染色观察肝脏病理改变,Masson染色观察胶原蛋白沉积情况,采用Image Pro Plus 6.0分析各组纤维化产物的光密度值(OD值);免疫组化染色法测定各组肝组织内α-SMA含量;Elisa法测定血清中ALT、AST、肝纤四项、TGF-β1、MMP-2、TIMP-2水平,Elisa法检测肝组织内细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6及IFN-γ含量;qRT-PCR法检测肝组织内Col-Ⅰ、Ⅲ mRNA相对表达量。3.体外实验初步探索SLI的作用机制CCK-8法测定SLI对人肝星状细胞LX-2增殖的影响,qRT-PCR检测Bax、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9 mRNA的变化和采用Western Blot法检测相应蛋白变化来探索体外实验中SLI对LX-2细胞的部分生物学机制。结果:1.肝脏病理形态学显示,肝纤维化模型成功建立。SLI可减轻CC14联合猪血清所致肝纤维化的程度。***可降低CC14所致的ALT、AST的升高(P0.05),降低TIMP-2和TGF-β1的表达(P0.01、P0.05),通过调节MMP-2/TIMP-2的平衡调控基质降解的过程;可降低促炎因子TNF-α、IL-6、IL-1β的表达(P0.01、P0.05),升高抗炎因子IFN-γ的表达(P0.05);可降低肝组织Col-Ⅰ、Col-Ⅲ mRNA表达量,有降低胶原蛋白沉积的作用。***对LX-2具有增殖抑制作用,且呈剂量和作用时间依赖性。SLI可通过促进Caspase-9 mRNA、Caspase-3 mRNA、Bax mRNA 的表达,而抑制 Bcl-2 mRNA 的表达从而促进LX-2细胞的凋亡,WB结果亦体现同样趋势。结论:SLI可通过抑制肝脏炎症因子的产生,调节MMP-2/TIMP-2平衡,降低胶原蛋白的合成缓解CC14联合猪血清诱导的大鼠肝纤维化程度。另外,SLI在体外可抑制LX-2细胞的增殖活性,其机制可能是通过抑制Bcl-2,提高Bax、Caspase-9、Caspase-3的活性有关