大鼠深低温停循环脑海马神经细胞内质网应激作用的研究

作     者：张有朋 

作者单位：天津医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘志刚

授予年度：2020年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100210[医学-外科学(含：普外、骨外、泌尿外、胸心外、神外、整形、烧伤、野战外)] 10[医学] 

主      题：内质网应激 体外循环 深低温停循环 葡萄糖调节蛋白78 未折叠蛋白反应 

摘      要：【目的】深低温停循环（deep hypothermic circulatory arrest,DHCA）是主动脉弓手术及复杂先心病矫治手术中的一项常用技术。DHCA通过中断循环血流为外科操作提供无血视野,完成手术目标,并通过控制性低体温,降低细胞代谢速率,保护神经系统免于缺血缺氧损害。然而,DHCA的低温状态及血流中断,仍然会导致术后神经系统并发症,例如癫痫发作,认知缺陷,多动和行为障碍等。本研究拟建立大鼠DHCA动物模型,通过测定对照组与DHCA组大鼠脑海马神经细胞GRP-78表达量的差异,探索DHCA是否诱发脑组织ERS。【方法】取Sprague-Dawley（SD）大鼠24只,随机分为两组:对照（Sham）组（n=12）,DHCA组（n=12）。大鼠称重后使用异氟烷吸入麻醉,麻醉成功后将大鼠固定于小动物电热毯,并备皮颈部、右侧大腿根部及尾根部皮肤。连接动物生命体征检测设备监测大鼠呼吸频率、心率、心电图及核心温度。使用颈静脉及尾动脉插管建立大鼠体外循环（cardiopulmonary bypass,CPB）模型,乳酸林格氏液预充CPB设备后于尾动脉输注肝素注射液进行全身肝素化,DHCA组于上述操作完成后开始CPB转机,观察颈静脉引流是否通畅防止置于右心房内的静脉引流管口负压,确认引流通畅后将流量逐渐增至目标灌注速度,体外膜肺由空氧混合装置供氧。DHCA组确认颈静脉引流通畅后转机5分钟开始降温,30分钟将核心温度降至17℃,在17℃的核心温度下诱导DHCA 45分钟,DHCA组停循环期间通过颈静脉插管排空心脏血液。DHCA后复温40分钟将核心温度恢复至36℃。在CPB期间连续监测心率、血压、核心温度、直肠温度、心电图并于转机前、停机前及处死前进行动脉血气分析,关注动脉氧分压及相关指标。Sham组仅建立动静脉插管及有创血压监测,不进行CPB转机,小动物呼吸机机械通气4小时。实验过程结束后实施安乐死,取大鼠脑海马组织,标本于液氮中保存。取出标本后按比例提取裂解液,低温超声研磨匀浆,在4℃环境下裂解30分钟使其充分裂解后将组织放入离心机中,在16000g的转速下离心20分钟,离心完成后提取上清液。利用Western Blot半定量法,经过制备SDS-PAGE凝胶、上样、电泳、转膜、封闭、一抗孕育、二抗孕育、发光、曝光及数据统计分析对内质网应激相关蛋白,葡萄糖调节蛋白78（glucose-regulated protein 78,GRP-78）进行蛋白质表达水平检测。实验所得数据用均数±标准差（（?）±s）表示,采用完全随机设计的单因素方差分析,组间两均数比较采用t检验分析,以P0.05为差异有统计学意义。【结果】DHCA组（n=12）GRP-78表达量（对比β-actin）为1.37±0.06,Sham组（n=12）GRP-78表达量（对比β-actin）为1.08±0.04,DHCA组较Sham组GRP-78表达有明显升高,差异有统计学意义（t=14.200,P=0.000**）。【结论】DHCA后大鼠脑海马神经细胞GRP-78表达量的增加,提示DHCA可能诱发脑海马神经细胞内质网应激。