果蝇TSMR1对BMP信号成员启动子活性的影响

作     者：罗艳 

作者单位：湖南师范大学 

学位级别：硕士

导师姓名：袁婺洲;吴秀山

授予年度：2017年

学科分类：0710[理学-生物学] 1002[医学-临床医学] 07[理学] 071007[理学-遗传学] 10[医学] 

主      题：果蝇 心脏发育 TSMR1 BMP信号 双荧光素酶报告分析 

摘      要：心血管疾病已经成为人类死亡率最高的恶性疾病之一。研究表明,脊椎动物的心脏发育是由特定基因精确表达、大量转录因子参与调控的一个复杂调控过程,因此通过对心脏发育相关分子机制的研究来找寻治疗该疾病的方法已成为科学家们急待解决的世界性难题。近几年来,BMP及其果蝇中的同源基因Dpp被证明在调节一些心脏转录因子如Tinman并诱导心肌分化中具有重要作用。缺少Dpp的果蝇胚胎的最终结果会缺少心脏组织,不能形成心脏中胚层并且缺少背部肌肉前体细胞,表明BMP信号途径在心脏发育及体壁肌肉发育过程中起着重要的作用。本论文主要是通过双荧光素酶报告系统在体外分子水平上检测TSMR1基因对BMP信号部分成员的启动子转录活性是否有影响。本文选取BMP信号通路成员包括配体基因Dpp,Ⅰ型受体基因Tkv,以及BMP信号通路中Smad家族成员中的受体特异型基因Mad,通用型基因Med和抑制型基因Dad。主要研究内容是通过分子克隆方法构建荧光素酶报告基因载体,检测上述BMP信号成员的启动子活性是否收到TSMR1基因的调控,以及是启动子的哪些区段发挥调控作用。取得的主要研究结果如下:1.首先克隆了Dpp,Tkv,Med,Dad,Mad等5个基因起始密码子ATG上游大约3000bp启动子区域,通过一步克隆法连接至p Gl3-basic载体构建荧光素酶报告基因质粒,共成功构建了p Gl3-Dpp-luc、p Gl3-Tkv-luc、p Gl3-Med-luc、p Gl3-Dad-luc、p Gl3-Mad-luc等5个基因启动子的重组报告基因质粒。同时构建了带myc标签的TSMR1重组表达质粒p CMV-myc-TSMR1。2.通过双荧光素酶报告基因活性分析,发现果蝇TSMR1基因能显著增强Dpp,Med,Tkv,Dad等基因的启动子转录活性,而对Mad基因的转录活性起抑制作用。3.进一步对BMP信号成员Dpp,Dad,Med等3个基因的启动子区域进行分段分析,将Dpp,Dad,Med 3个基因的5’端启动子序列分别分成6段截短的启动子片段,通过PCR扩增后,再用一步克隆法连接至p Gl3-basic载体,成功构建了含不同截短长度的启动子拆片荧光素酶报告基因质粒。4.通过双荧光素酶报告基因系统检测,发现TSMR1调控Dpp核心启动子区域位于-493bp一-33bp,调控Med核心启动子区位于-396bp一+105bp,调控Dad核心启动子区域位于-1299bp一-762bp。分析TSMR1基因可能主要结合在这些核心启动子区域从而激活Dpp,Dad,Med的转录活性。