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人tsmr1基因与心脏发育主控基因MESP1的调控关系分析

人TSMR1基因与心脏发育主控基因MESP1的调控关系分析

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作者：刘艳琴湖南师范大学

学位级别：硕士

心脏是人体最重要的器官之一,其发育过程受一系列基因控制,这些基因的突变或表达异常将导致各种心脏疾病的发生。因此,阐明心脏发育相关基因的调控关系对心脏疾病的诊断和治疗具有十分重要的作用。已知MESP1属于b HLH转录因子家族,是脊... 详细信息

心脏是人体最重要的器官之一,其发育过程受一系列基因控制,这些基因的突变或表达异常将导致各种心脏疾病的发生。因此,阐明心脏发育相关基因的调控关系对心脏疾病的诊断和治疗具有十分重要的作用。已知MESP1属于b HLH转录因子家族,是脊椎动物心脏发育的主控基因,位于心脏发育基因调控网络的最顶端。有趣的是,果蝇中不存在MESP1基因的同源基因,此前也未发现控制果蝇心脏发育的主控基因。tsmr1基因是本实验室前期利用果蝇模型鉴定出的一个心脏发育基因,目前已证明该基因是控制果蝇心脏发育的主控基因。生物信息学分析结果表明,tsmr1基因从果蝇到人类在进化上高度保守,那么tsmr1在脊椎动物和人类心脏发育过程中是否也具有重要作用呢?因此,本文利用HEK293T细胞(人胚胎肾细胞)探究人类tsmr1基因与MESP1基因的调控关系。为探究人tsmr1过表达后对MESP1基因及其下游心脏中胚层特化基因表达的影响,我们首先在HEK293T细胞中过表达人tsmr1基因,利用q RT-PCR、Western Blot技术检测MESP1基因及其下游心脏中胚层特化基因Nkx2-5、GATA4和TBX5的表达变化。实验结果表明,过表达tsmr1明显上调MESP1基因在转录和翻译水平的表达,且MESP1下游心脏中胚层特化基因的表达也发生变化。双荧光素酶报告系统分析是一种研究基因调控关系的有效方法。本文以提取的人类基因组为模板克隆出MESP1、Nkx2-5、GATA4和TBX5等基因的启动子片段,并构建这些基因的荧光素酶报告质粒进行双荧光素酶报告系统分析。检测结果显示,过表达tsmr1显著增强MESP1、Nkx2-5、GATA4以及TBX5等基因启动子的荧光素酶活性。这些结果表明人tsmr1基因可能位于MESP1基因上游,正调控MESP1基因的表达。为了进一步探讨MESP1基因是否是tsmr1基因的直接靶基因,本文首先利用生物信息学分析MESP1基因启动子在生物进化过程中的保守结合基序(Motif),结果显示人MESP1基因启动子上存在3个保守结合基序(M-Motif-1、M-Motif-2、M-Motif-3)。同时,以p GL3-MESP1荧光素酶报告质粒为基础进行亚克隆,成功构建了3个逐段缺失MESP1基因启动子序列的荧光素酶报告质粒。染色质免疫共沉淀实验以及双荧光素酶报告系统分析结果显示tsmr1可能通过结合在MESP1基因ATG上游-1101～-843bp区域内的保守结合基序M-Motif-3上调控MESP1基因的转录活性。这些结果表明,tsmr1可以结合在MESP1基因启动子上直接调控其转录表达,暗示tsmr1有可能通过MESP1基因调控脊椎动物与人类心脏的发育。近年来的研究逐渐揭示了组蛋白变体H2A.Z可通过表观遗传学调控机制参与基因的转录调控。有研究表明H2A.Z蛋白在染色质上的沉积(deposition)和移除调控基因的转录活性。实验室前期工作表明tsmr1与H2A.Z之间存在蛋白相互作用,提示tsmr1可能通过H2A.Z调控机制调控心脏发育相关基因的转录表达。因此,本文又探究了人tsmr1对组蛋白变体H2A.Z的转录调控作用。首先,我们在HEK293T细胞中过表达人tsmr1基因,通过qRT-PCR检测发现过表达tsmr1后H2A.Z基因mRNA水平的表达明显上调。本文克隆了H2A.Z基因启动子片段并构建了H2A.Z基因启动子荧光素酶报告质粒,双荧光素酶报告系统分析结果表明过表达tsmr1可显著增强H2A.Z基因启动子的荧光素酶活性。这些结果提示人tsmr1基因可能位于H2A.Z基因上游,正调控H2A.Z基因的表达。接着,本文通过生物信息学分析发现H2A.Z基因启动子在生物进化过程中也存在3个保守结合基序(H-Motif-1、H-Motif-2、H-Motif-3)。以p GL3-H2A.Z荧光素酶报告质粒为基础进行亚克隆,建了5个逐段缺失H2A.Z基因启动子序列的荧光素酶报告质粒。染色质免疫共沉淀实验以及双荧光素酶报告系统分析结果进一步证明tsmr1可能通过结合在H2A.Z基因ATG上游-709～-433bp区域内的保守结合基序H-Motif-3上调控该基因的转录活性。以上结果表明,tsmr1可以结合在H2A.Z基因启动子上直接调控其转录表达。综上,本文研究利用HEK293T细胞过表达模型,首次证明了人tsmr1基因与心脏发育主控基因MESP1之间存在调控关系,人tsmr1可直接结合在MESP1启动子上,上调MESP1及其下游部分心脏中胚层特化基因的表达,提示tsmr1可能是脊椎动物与人类心脏发育的主控基因。本文研究还发现人tsmr1可影响组蛋白变体H2A.Z的表达,故进一步提出猜想:人tsmr1有可能通过H2A.Z调控机制调控MESP1等心脏发育相关基因的转录表达。本文研究结果为进一步研究心脏发育的分子调控机制提供了研究线索。

关键词： tsmr1 MESP1 H2A.Z 表达调控

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果蝇tsmr1对BMP信号成员启动子活性的影响

果蝇TSMR1对BMP信号成员启动子活性的影响

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作者：罗艳湖南师范大学

学位级别：硕士

心血管疾病已经成为人类死亡率最高的恶性疾病之一。研究表明,脊椎动物的心脏发育是由特定基因精确表达、大量转录因子参与调控的一个复杂调控过程,因此通过对心脏发育相关分子机制的研究来找寻治疗该疾病的方法已成为科学家们急待解决... 详细信息

心血管疾病已经成为人类死亡率最高的恶性疾病之一。研究表明,脊椎动物的心脏发育是由特定基因精确表达、大量转录因子参与调控的一个复杂调控过程,因此通过对心脏发育相关分子机制的研究来找寻治疗该疾病的方法已成为科学家们急待解决的世界性难题。近几年来,BMP及其果蝇中的同源基因Dpp被证明在调节一些心脏转录因子如Tinman并诱导心肌分化中具有重要作用。缺少Dpp的果蝇胚胎的最终结果会缺少心脏组织,不能形成心脏中胚层并且缺少背部肌肉前体细胞,表明BMP信号途径在心脏发育及体壁肌肉发育过程中起着重要的作用。本论文主要是通过双荧光素酶报告系统在体外分子水平上检测tsmr1基因对BMP信号部分成员的启动子转录活性是否有影响。本文选取BMP信号通路成员包括配体基因Dpp,Ⅰ型受体基因Tkv,以及BMP信号通路中Smad家族成员中的受体特异型基因Mad,通用型基因Med和抑制型基因Dad。主要研究内容是通过分子克隆方法构建荧光素酶报告基因载体,检测上述BMP信号成员的启动子活性是否收到tsmr1基因的调控,以及是启动子的哪些区段发挥调控作用。取得的主要研究结果如下:1.首先克隆了Dpp,Tkv,Med,Dad,Mad等5个基因起始密码子ATG上游大约3000bp启动子区域,通过一步克隆法连接至p Gl3-basic载体构建荧光素酶报告基因质粒,共成功构建了p Gl3-Dpp-luc、p Gl3-Tkv-luc、p Gl3-Med-luc、p Gl3-Dad-luc、p Gl3-Mad-luc等5个基因启动子的重组报告基因质粒。同时构建了带myc标签的tsmr1重组表达质粒p CMV-myc-tsmr1。2.通过双荧光素酶报告基因活性分析,发现果蝇tsmr1基因能显著增强Dpp,Med,Tkv,Dad等基因的启动子转录活性,而对Mad基因的转录活性起抑制作用。3.进一步对BMP信号成员Dpp,Dad,Med等3个基因的启动子区域进行分段分析,将Dpp,Dad,Med 3个基因的5’端启动子序列分别分成6段截短的启动子片段,通过PCR扩增后,再用一步克隆法连接至p Gl3-basic载体,成功构建了含不同截短长度的启动子拆片荧光素酶报告基因质粒。4.通过双荧光素酶报告基因系统检测,发现tsmr1调控Dpp核心启动子区域位于-493bp一-33bp,调控Med核心启动子区位于-396bp一+105bp,调控Dad核心启动子区域位于-1299bp一-762bp。分析tsmr1基因可能主要结合在这些核心启动子区域从而激活Dpp,Dad,Med的转录活性。

关键词：果蝇心脏发育 tsmr1 BMP信号双荧光素酶报告分析

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