长链非编码RNA HOXD-AS2靶向调控HOXD8经由PI3K/Akt信号通路抑制胃癌侵袭转移的实验研究

作     者：姚林 

作者单位：川北医学院 

学位级别：硕士

导师姓名：肖江卫

授予年度：2020年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：长链非编码RNA 胃癌 HOXD-AS2 HOXD8 PI3K/Akt信号通路 

摘      要：目的:探讨长链非编码 RNA(long non-coding RNA,lncRNA)HOXD-AS2在胃癌中的表达情况,以及其在胃癌发生发展过程中所扮演的角色,对胃癌细胞生物学行为的影响和具体的调控机制。方法:(1)根据前期芯片结果,筛选出芯片中表达差异较大的HOXD-AS2,再通过实时荧光定量PCR(RT-qPCR)在79例胃癌组织和其对应的癌旁组织、胃癌细胞系及正常胃粘膜细胞中验证HOXD-AS2的表达水平。(2)分析HOXD-AS2表达水平与胃癌患者临床病理特征之间的关系,评估其在胃癌预后中的价值。(3)RT-qPCR和蛋白免疫印迹(Western-blot,WB)检测HOXD8在胃癌组织和细胞中的表达情况,并使用在线数据库预测与HOXD-AS2相关的共表达基因HOXD8,以及其与胃癌患者预后的关系。(4)HOXD-AS2与HOXD8的表达作用关系,通过circlncRNAnet预测与spearman相关性分析明确两者之间的相互作用关系。(5)划痕和Transwell实验验证,过表达HOXD-AS2后对胃癌细胞侵袭转移能力的影响。(6)体外实验中过表达HOXD-AS2,观察靶基因HOXD8,以及PI3K/Akt信号通路的水平变化来探讨HOXD-AS2在胃癌侵袭、转移中的作用及调控机制。结果:(1)在胃癌组织和胃癌细胞中HOXD-AS2表达降低。(2)低表达的HOXD-AS2与胃癌患者淋巴结转移和TNM分期相关,HOXD-AS2的表达水平可以作为影响胃癌侵袭转移的独立风险因素。(3)Kaplan Meier Plotter数据库生存分析结果显示HOXD-AS2低表达的胃癌患者生存时间更短,预后更差。(4)HOXD8mRNA在胃癌组织表达水平明显低于癌旁组织,胃癌细胞中明显低于正常胃粘膜细胞,HOXD8表达水平与HOXD-AS2表达水平呈正相关性,提示HOXD8极可能是HOXD-AS2靶调控基因。(5)使用质粒为载体的pc-HOXD-AS2过表达HOXD-AS2后,明显抑制了胃癌细胞SGC-7901和SNU-1的侵袭和转移能力。(6)同时SGC-7901和SNU-1胃癌细胞中HOXD8与p53蛋白水平明显上调,PI3K/Akt信号通路中关键蛋白PI3K、Akt和MDM2表达水平受抑制。(7)特异性PI3K/Akt信号通路抑制剂LY294002 处理胃癌细胞 SGC-7901 和 SNU-1 后,HOXD-AS2 与 HOXD8表达水平明显增加。结论:(1)HOXD-AS2在胃癌组织及胃癌细胞系中低表达,与胃癌淋巴转移、TNM分期正相关。生存分析显示HOXD-AS2低表达的患者生存时间更短,预后更差。研究结果提示HOXD-AS2可能参与促进了胃癌的侵袭、转移调控。(2)HOXD8在胃癌组织及胃癌细胞系中呈低表达,HOXD-AS2表达水平与HOXD8mRNA表达水平呈正相关,过表达HOXD-AS2后可以上调HOXD8蛋白水平,提示HOXD8是HOXD-AS2靶调控基因。(3)过表达HOXD-AS2后可以抑制PI3K/Akt信号通路的活性,反过来特异性抑制PI3K/Akt信号通路后也可以上调HOXD-AS2表达水平和HOXD8蛋白表达水平,而且均可抑制胃癌细胞侵袭和转移的能力。研究结果提示HOXD-AS2极有可能通过靶向调控HOXD8基因,抑制PI3K/Akt信号通路活性从而抑制胃癌细胞的侵袭和转移。