磷酸化STAT3在慢性束缚应激致大鼠脾损伤中的作用及相关机制研究

作     者：宋曼玉 

作者单位：东北农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：范宏刚

授予年度：2020年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：大鼠慢性应激 细胞凋亡 STAT3 内质网应激 未折叠蛋白反应 

摘      要：长期不良的慢性应激已经被证明可以严重影响畜牧生产及动物健康状况,这种影响主要是由连接神经、内分泌和免疫系统的HPA轴引起的。脾脏是成年哺乳动物体内细胞免疫和体液免疫的中心,目前研究已经证明在慢性应激中发生由HPA轴介导脾细胞数量减少,但导致这种情况的确切机制仍有待阐明,临床上也缺乏相应的诊治方案与治疗药物。STAT3作为与细胞增殖和免疫机能密切相关的转录因子,已经发现其表达量在遭受慢性应激的动物的脾脏中上升,但慢性应激中高表达的p-STAT3是否与脾细胞的凋亡有关还缺少相关研究。因此本试验通过建立大鼠慢性束缚应激模型,从组织水平与分子水平探究慢性应激致脾损伤的机制,并通过使用p-STAT3在体抑制剂S3I-201探究p-STAT3与未折叠蛋白反应在慢性应激脾脏中的作用。为今后临床研究抗应激药物,筛选治疗靶点奠定基础。选取56只健康雄性Wistar大鼠进行试验,随机分为空白对照组（C组,16只）、慢性应激组（CS组,16只）、抑制剂对照组（C+S3I-201组,6只）、抑制剂组（CS+S3I-201组,6只）、溶剂对照组（C+DMSO组,6只）及溶剂组（CS+DMSO组,6只）。对C+S3I-201组、CS+S3I-201组、C+DMSO组及CS+DMSO组自造模开始每隔2 d腹腔注射相应药物,对CS组、CS+S3I-201组及CS+DMSO组进行为期21 d的束缚应激。应激程序结束后立刻从各组各取6只大鼠,经心脏采血处死后取脾脏备用。C组与CS组其余10只大鼠于第22天进行行为学检测。通过旷场试验结果与血清中皮质酮含量变化检测模型建立是否成功;通过观察脾脏病理组织切片,凋亡相关蛋白及TUNEL试验检测大鼠脾脏损伤情况;通过检测3条凋亡途径相关蛋白表达量探究脾细胞凋亡水平变化的调控通路。行为学试验结果表明,与C组相比CS组大鼠出现显著的焦虑样行为（p0.01）;ELISA检测显示CS组血清中皮质酮含量显著高于C组（p0.01）。Western Blot结果显示CS组IL-10表达量显著升高（p0.01）且不受S3I-201影响（p0.05）,IL-6表达水平不受慢性应激或抑制剂的影响（p0.05）。CS组p-STAT3/STAT3相对表达量显著提高（p0.01）而CS+S3I-201组其相对表达量与CS组相比显著降低（p0.01）。组织病理学显示CS组脾脏白髓萎缩,边缘区破裂,而在CS+S3I-201组大鼠束缚过程中抑制p-STAT3使脾脏失去典型结构。Cleaved caspase-3/Caspase-3相对表达量及TUNEL结果都表明CS组大鼠脾细胞发生了显著凋亡（p0.01）,而CS+S3I-201组细胞凋亡水平又显著高于CS组（p0.01）。这些结果证明在慢性应激中抑制p-STAT3的表达加重了脾细胞凋亡。Bcl-2,Bax,Bcl-x L蛋白表达量不受慢性应激或抑制剂的影响（p0.05）。CS组procaspase-8蛋白表达量显著高于C组（p0.01）,而CS+S3I-201组与CS组相比无显著差异（p0.05）。GRP78蛋白表达量CS+S3I-201组显著高于C组（p0.01）。CS+S3I-201组CHOP、p-JNK/JNK、procaspase-12蛋白表达量显著高于C组（p0.01）,而其他组与C组相比无显著差异（p0.05）。CS组p-e IF2α蛋白表达量与C组相比显著提高（p0.01）,CS+S3I-201组与CS组相比无显著差异（p0.05）;CS组的ATF-6α（p0.05）及p-IRE1α（p0.01）蛋白表达量高于C组,而CS+S3I-201组ATF-6α（p0.05）及p-IRE1α（p0.01）蛋白表达量低于CS组。综合分析试验结果表明,线粒体凋亡途径既不受慢性应激影响也不被STAT3调控;在慢性束缚应激中引起脾细胞凋亡的主要途径是死亡受体途径,但该途径不被p-STAT3抑制所影响;在慢性束缚应激中未折叠蛋白反应被激活,p-STAT3的抑制会扰乱这种保护作用激活内质网应激而增强脾细胞凋亡。本研究表明,STAT3和未折叠蛋白反应在治疗慢性应激引起的脾脏损伤方面是潜在的治疗靶点。