低剂量阿司匹林对滋养细胞脂肪酸代谢和分化影响的检测分析及机制探索

作     者：段福梅 

作者单位：重庆医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：丁裕斌

授予年度：2020年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100211[医学-妇产科学] 10[医学] 

主      题：ASA 滋养细胞 合体化 脂肪酸代谢 THBS1 

摘      要：妊娠期胎盘是母体与胎儿之间进行营养代谢的重要器官。合体滋养细胞（Syncytiotrophoblast,STB）作为胎盘上最重要的功能细胞,其功能正常与否与胎儿体重密切相关。目前,妊娠期孕产妇服用低剂量阿司匹林（Acetylsalicylic acid,ASA）可以改善胎源性相关疾病的妊娠结局已被明确证实,并被多个国家和组织列入多种妊娠期疾病以及相关并发症的预防和治疗指南。然而,ASA除了其抗血栓的经典药理途径之外,是否能通过调控胎盘滋养细胞的脂肪酸代谢、增殖或分化过程来改善胎盘功能,目前仍不清楚。本研究拟利用人胎盘组织,原代滋养细胞和BeWo细胞系为材料,采用相关分子生物学技术,深入探究以下问题:低剂量ASA引起的滋养细胞脂肪酸代谢及合体化过程基因表达变化,分析差异基因影响的生物过程;低剂量ASA对滋养细胞脂肪酸转运和合成功能的影响;低剂量ASA影响滋养细胞合体化过程的机制研究。一、低剂量ASA处理前后滋养细胞中的差异表达基因为明确ASA对细胞滋养层细胞系（BeWo）的生物学作用。首先,筛选ASA最佳的药物作用浓度以及处理时间。本研究使用0.01mM、0.1mM、0.5mM和1mM ASA处理BeWo细胞不同时间,CCK8结果显示,随着ASA作用浓度的增加其毒性作用增强;并且1mM ASA处理细胞1h、5h、10h、24h和48h后,发现其毒性作用随时间的延长而增强。因此,确定1mM培养24h为工作浓度和时间。进而,我们采用1mM ASA处理BeWo细胞24h,通过转录组测序发现与脂肪酸合成、氧化和转运相关的关键蛋白差异表达,滋养细胞合体化标志蛋白表达上调。对差异基因进行GO及KEGG分析,结果显示差异基因主要富集于质膜表面,主要参与细胞脂肪酸代谢等营养物质代谢过程;其中还包括滋养细胞合体化相关基因,并涉及cAMP信号通路。二、低剂量ASA对滋养细胞脂肪酸代谢过程的影响1mM ASA处理BeWo细胞后,通过RT-qPCR对脂肪酸代谢相关基因进行定量分析。结果显示脂肪酸结合蛋白（FABPs）,脂肪酸转运蛋白（FATPs）,脂肪酸合成酶（FASN）,乙酰辅酶A羧化酶（ACC）肉碱棕榈酰转移酶1A（CPT1A）,脂肪酸代谢相关转录因子（PPARγ、PPARα）的mRNA水平均上调,表明低剂量ASA影响脂肪酸转运、合成及氧化过程。激光共聚焦显微镜活细胞成像技术显示低剂量ASA可显著增加BeWo细胞摄取游离脂肪酸的效率。这些结果均提示低剂量ASA增加滋养细胞的脂肪酸代谢功能。三、低剂量ASA对滋养细胞合体化过程的影响在人类胎盘的发育过程中,STB由细胞滋养细胞（Cytotrophoblast,CTB）不断分化融合而来。1mM ASA处理BeWo细胞24小时后,转录组分析显示差异基因富集于cAMP信号通路,合体化标志基因上调表达;而细胞融合相关因子THBS1及其受体CD36下调表达,与RT-qPCR定量结果一致。利用原代滋养细胞自发合体化以及建立BeWo细胞合体化模型,并通过Western blot、RT-qPCR、CO-IP等技术,发现合体化过程中THBS1和CD36表达下调以及两者的相互作用;THBS1的过表达则抑制cAMP信号通路的激活从而降低合体化效率。以上结果说明低剂量ASA引起的THBS1表达下调有利于滋养细胞合体化。综上,本研究初步探讨了低剂量ASA对胎盘滋养细胞脂肪酸代谢以及细胞合体化过程的影响。通过转录组测序分析BeWo细胞经ASA处理前后的差异表达基因,分析了低剂量ASA对滋养细胞脂肪酸代谢及合体化相关基因表达的影响,将来可能为进一步探究低剂量ASA改善胎盘滋养细胞功能以及调控机制提供新的线索,并为其他新药的研制和应用于防治胎盘源性相关疾病的发生提供新思路。