慢性心理应激对肝纤维化大鼠肠道菌群和肝脏病理的影响及机制研究

作     者：李梦莹 

作者单位：河南大学 

学位级别：硕士

导师姓名：兰玲

授予年度：2020年

学科分类：1002[医学-临床医学] 10[医学] 

主      题：肝纤维化 慢性心理应激 菌群紊乱 细菌移位 “肠-肝”轴 

摘      要：背景:随着医学模式从“生物医学模式向“生物-心理-社会医学模式的转变,慢性心理应激作为一种影响因素促进肝纤维化的发展逐渐被重视,但机制暂不明确。进展期肝病常伴有肠源性内毒素血症（Intestinal Endotoxemia,IETM）,发生肠道细菌移位,内毒素的主要成分脂多糖（Lipopolysaccharide,LPS）可借助肝内4型Toll样受体4（To11-like receptor 4,TLR4）启动细胞内信号转导,介导炎症级联反应,激活枯否细胞和肝星状细胞,促进细胞外基质的生成,导致肝纤维化的加重,此即“肠-肝轴。而心理应激与肠道之间也有交互效应,“脑-肠轴的存在已成为共识。心理应激可通过“脑-肠轴导致肠道菌群紊乱、促进肠道细菌移位。由此我们设想慢性心理应激可能通过肠道间接影响肝脏,即慢性心理应激引起肠道菌群紊乱、细菌移位导致血内LPS水平增加,继而通过“肠-肝轴作用导致肝脏损伤和肝纤维化加重。目的:观察慢性心理应激对肝纤维化大鼠肠道菌群及肝脏病理的影响,并检测该过程中“肠-肝轴肝细胞内信号转导途径的变化情况,探讨慢性心理应激影响纤维化进展的可能作用机制。方法:选取正常SD大鼠60只,随机均分为6组:（1）正常组:正常大鼠,无建模;（2）橄榄油组:肝纤维化阴性对照模型,橄榄油皮下注射,3ml/kg,2次/周,首剂加倍,8周成模;（3）肝纤维化组:肝纤维化模型,40%四氯化碳皮下注射,剂量、时间同橄榄油组;（4）心理应激组:正常大鼠在第5周起行慢性心理应激4周;（5）橄榄油+心理应激组:在肝纤维化阴性对照模型建立的第5周起行慢性心理应激4周;（6）肝纤维化+心理应激组:在肝纤维化模型建立的第5周起行慢性心理应激4周。所有大鼠饲养8周后处死,取盲肠内容物（肠道粪便）,采用16S r RNA测序分析检测肠道粪便中的肠道菌群多样性;取门静脉血,采用血浆偶氮显色法检测门静脉血中LPS水平;取肝组织,采用Masson染色法检测肝组织胶原沉积情况并行半定量分期对肝纤维化程度评分,采用免疫组化法检测肝脏细胞内TLR4、My D88、NF-κβ、TNF-α、IL-1、IL-6、TRIF、TRAM、IRF-3和IFN-β的蛋白表达情况并测量IOD值对上述蛋白行相对定量。结果:1、大鼠肠道菌群Beta多样性在橄榄油、心理应激和肝纤维化3种因素作用下均发生不同程度的偏移。同正常组相比,慢性心理应激致大鼠肠道WPS-2菌门丰度显著升高（P0.01）,肝纤维化致大鼠肠道厚壁菌门丰度下降,放线菌门、螺旋体门和软壁菌门丰度上升。其中单纯肝纤维化组还出现拟杆菌门丰度上升,而肝纤维化+心理应激组则另出现Patescibacteria菌门（P=0.047）和WPS-2菌门（P=0.000）丰度的显著升高。2、正常组、橄榄油组大鼠门静脉血中有低水平LPS存留,心理应激组、肝纤维化组和肝纤维化+心理应激组大鼠的门静脉血LPS水平均较之明显升高（P0.05）,且三组大鼠门脉血LPS水平依次呈梯度上升（P0.05）。3、同正常组及橄榄油组大鼠相比,肝纤维化组大鼠肝组织胶原纤维沉积明显,小叶间结构紊乱,肝纤维化分期评分明显增高（P0.05）。施加慢性心理应激后各组大鼠肝脏组织均出现病理损伤。肝纤维化大鼠在心理应激作用下,肝组织组胶原纤维大量沉积,假小叶形成,肝纤维化分期评分较前有升高趋势但统计学差异不明显（P0.05）。4、同正常组及橄榄油组大鼠相比,肝纤维化组大鼠中肝脏细胞内TLR4、My D88、NF-κβ、AP-1、TNF-α、IL-6、TRIF、TRAM、IRF-3和IFN-β的蛋白表达量明显升高（P0.05）,在慢性心理应激作用下,其上述蛋白的表达量均较前进一步明显上升（P0.01）。结论:1、慢性心理应激可通过“脑-肠轴介导肠道菌群紊乱,引发细菌移位,导致门脉血LPS水平升高。2、慢性心理应激可作为独立影响因素导致并加重肝脏病理损伤,促进肝纤维化大鼠肝纤维化程度的进展。3、由LPS-TLR4信号通路介导的“肠-肝轴肝细胞内转导途径在肝纤维化的发展过程中起到重要作用。4、慢性心理应激可先后促进“脑-肠轴及“肠-肝轴的激活,可能是其间接加重肝脏病理损伤,促进肝纤维化发展的体内作用机制。