ROCK2通过稳定PFKFB3的表达促进骨肉瘤生长和转移作用研究

作     者：邓雪强 

作者单位：南昌大学 

学位级别：硕士

导师姓名：郝亮

授予年度：2020年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：ROCK2 PFKFB3 骨肉瘤 生长 转移 泛素化 

摘      要：研究背景和目的:骨肉瘤是最为常见的骨组织来源的恶性肿瘤,同时也是儿童恶性肿瘤的主要类型之一。其具有恶性程度高、生长迅速、易发生侵袭及迁移等特点,患者整体预后差,术后生存率低下。因此,有效的分子靶点对骨肉瘤的治疗极其重要。ROCK2在肿瘤的进展中扮演着重要角色,目前认为其可以调节细胞的收缩与粘附、侵袭及迁移、增殖和凋亡,然而其在骨肉瘤中的表达及影响机制并不清楚。在肿瘤的恶性进展中糖酵解水平显著提升,PFKFB3作为糖酵解及能量代谢的调节者,研究证实其在肿瘤的发展中起着关键性作用,然而,PFKFB3在骨肉瘤中的作用及机制研究却很少。本研究旨在探讨骨肉瘤中ROCK2及PFKFB3的表达及相关性,进一步深入探究其影响骨肉瘤生长及转移的机制。方法:1、免疫组化、荧光定量PCR及免疫印迹法分析ROCK2在骨肉瘤组织中的表达。2、筛选出下调效果最佳的shROCK2质粒并下调骨肉瘤细胞中ROCK2的表达,通过CCK8、EdU实验观察细胞生长能力的变化。然后采用流式细胞术检测细胞周期及凋亡比例变化。接下来通过划痕愈合和Transwell实验观察细胞侵袭及迁移能力的影响。最后我们利用稳定转染shNC/U2-OS、shROCK2/U2-OS骨肉瘤细胞株建立人骨肉瘤皮下瘤模型,观察裸鼠的成瘤情况。并通过尾静脉注射转染shNC/U2-OS、shROCK2/U2-OS骨肉瘤细胞,观察双肺骨肉瘤细胞转移的发生情况。3、改变ROCK2表达后,分析骨肉瘤细胞中PFKFB3的表达情况。并检测骨肉瘤组织及相应非癌组织中PFKFB3的表达,进一步分析肿瘤组织中PFKFB3与ROCK2表达的相关性。最后在稳定低表达ROCK2的细胞中同时上调PFKFB3及过表达ROCK2的细胞中同时降低PFKFB3的表达,采用EdU观察肿瘤细胞生长情况,通过Transwell实验分析其转移能力。4、采用Co-IP检测U2-OS及MG-63细胞中ROCK2与PFKFB3之间能否直接相互结合。阻断细胞蛋白降解及合成的基础下,免疫印迹法检测过表达及沉默ROCK2后对PFKFB3表达的影响。Co-IP检测过表达及沉默肿瘤细胞中ROCK2对PFKFB3的泛素化水平影响。结果:1、免疫组化结果显示,ROCK2在72.55%（37/51）肿瘤组织中表达提升,而相应的正常骨组织中升高仅为13.73%（7/51）（p0.01）。荧光定量PCR和免疫印迹结果证实ROCK2在骨肉瘤组织中的表达水平显著升高（p0.01）。2、下调U2-OS及MG-63细胞中ROCK2的表达后,CCK8、EdU实验表明其生长能力减弱（p0.01）;细胞周期于G1期阻滞;凋亡比例明显升高（p0.05）;划痕愈合及Transwell实验表明其侵袭及迁移能力也显著被抑制（p0.01）;体内实验也证实了降低ROCK2水平后裸鼠瘤体的大小及肺转移的发生数少于相应的对照组（p0.05）。3、下调肿瘤细胞中ROCK2的表达后,PFKFB3的表达水平也随之下降。相反过表达ROCK2后,PFKFB3随之上升。骨肉瘤组织中PFKFB3的表达水平显著提升,且与ROCK2的表达水平呈正相关。另外,我们研究发现上调PFKFB3的表达可以逆转沉默ROCK2所导致的骨肉瘤增殖及转移能力下降,而降低PFKFB3的表达则可以抑制过表达ROCK2所导致的骨肉瘤增殖及转移能力增强。4、Co-IP结果证实ROCK2与PFKFB3直接结合。进一步采用蛋白酶抑制剂MG132作用骨肉瘤细胞,PFKFB3的表达随着MG132的作用时间的累积而增加。在阻断蛋白酶体降解的情况下,沉默及过表达ROCK2后,PFKFB3蛋白表达无明显变化且PFKFB3在肿瘤细胞中的降解速率明显减低。进一步我们研究发现ROCK2能够抑制骨肉瘤细胞中PFKFB3的泛素化降解过程。结论:ROCK2通过稳定PFKFB3的表达进而促进骨肉瘤的生长与转移。我们的结果为研究骨肉瘤生长及转移机制提供了新的理论基础,并将为骨肉瘤的靶向治疗提供一个新的理论研究方向。