miR-184通过STC2-IGF1调控奶山羊子宫内膜上皮细胞凋亡的研究

作     者：车思成 

作者单位：西北农林科技大学 

学位级别：硕士

导师姓名：曹斌云

授予年度：2020年

学科分类：0905[农学-畜牧学] 09[农学] 

主      题：西农萨能奶山羊 EECs 凋亡 miR-184 STC2 IGF1 

摘      要：非编码小RNA（miRNAs）在哺乳动物体内各个组织表达并调控机体各项生理活动,子宫中其含量也非常丰富。研究显示miR-184可以调控细胞的凋亡与增殖,但其对奶山羊子宫内膜上皮细胞（EECs）的作用机制研究甚少。本课题组前期在奶山羊子宫内膜容受期（RE）容受前期（PE）的miRNA高通量测序结果表明miR-184与RE富集程度较之PE上升31倍（P0.01）。本研究通过生物信息学分析预测并筛选出STC2是miR-184的靶基因,并且STC2在胚胎着床期间发挥关键的调控作用。然而STC2在奶山羊EECs中的分子调控机理尚不清楚。本研究以奶山羊子宫内膜上皮细胞（EECs）为研究对象,通过stem-loop RT-qPCR和RT-qPCR检测miR-184与STC2在RE与PE中的表达量。构建野生型（WT）与突变型（Mut）psi CHECK2-STC2-3′UTR载体,并利用RNA干扰、RT-qPCR、Western blot、CCK8、流式细胞术、EDU等试验技术,研究miR-184通过STC2-IGF1对奶山羊EECs的调控作用。主要研究结果如下:1.miR-184在RE中的表达丰度升高,而STC2 mRNA的表达丰度降低本研究采用stem-loop RT-qPCR和RT-qPCR验证miR-184和STC2 mRNA在奶山羊RE与PE的相对表达量,结果显示RE中的miR-184表达丰度相较于PE升高（P0.01）,而STC2mRNA表达丰度降低（P0.01）。2.STC2是miR-184的靶基因本研究成功构建了野生型（WT）与突变型（Mut）psi CHECK2-STC2-3′UTR载体,对miR-184与野生型或突变型psi CHECK2-STC2-3′UTR载体质粒共转处理组检测两种荧光强度。双荧光检测结果显示miR-184使野生型的海肾荧光值同萤火虫荧光值的比值降低,但对突变型的无显著性影响,这一结果初步表明STC2是miR-184的靶基因。另外,Western blot检测发现miR-184使STC2在蛋白水平上的表达量显著（P0.05）下降,miR-184可靶向下调STC2在EECs中的表达量。3.miR-184通过STC2-IGF1轴抑制EECs增殖,并诱导其凋亡。在EECs中,Western blot试验结果表明miR-184能够抑制RAS/ERK通路的活性,并在蛋白水平下调了BCL2/BAX的比值,同时通过CCK8、流式细胞分析、EDU等试验检测表明miR-184诱导EECs凋亡,抑制EECs增殖。进一步研究发现,STC2显著（P0.05）的激活了RAS/ERK通路上蛋白的磷酸化水平,并使BCL2/BAX的比值显著（P0.05）的升高。同时,CCK8、EDU和流式细胞分析等试验结果显示STC2抑制EECs凋亡,并促进了EECs增殖。研究发现STC2可上调IGF1在EECs中的蛋白水平,而siSTC2下调了IGF1的表达量;IGF1能激活RAS/ERK信号通路,并上调BCL2/BAX的比值;这表明STC2可通过IGF1介导的RAS/ERK信号通路促进EECs增殖。综上所述,miR-184通过STC2-IGF1轴经RAS/ERK信号通路抑制EECs增殖,并诱导其凋亡。