DNAJA1调控结直肠癌增殖的作用及其分子机制

作     者：杨少珊 

作者单位：南方医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：梁莉

授予年度：2017年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：DNAJA1 结直肠癌 增殖 

摘      要：研究背景和目的结直肠癌是世界上第三大最常见的肿瘤、第四大致死性的肿瘤,每年约有1,361,000人被确诊为结直肠癌,并且每年约有694,000名患者的死因是结直肠癌[1]。结直肠癌转移是影响结直肠癌患者疗效和死亡的重要因素。因此阐明结直肠癌发生、发展的分子机制,仍是目前研究的重要方向。DnaJ Heat Shock Protein Family Member A1(DNAJA1)是本课题组前期通过原位杂交筛选出来的FMNL2相互作用蛋白,是热休克蛋白家族(Heatshock proteins,HSPs)下的分子伴侣家族HSP40的成员之一,其特征是具有一个高度保守的氨基酸端J结构域。近几年的研究结果显示,HSPs蛋白与肿瘤细胞的增殖、侵袭、分化、转移及死亡都有密切关系。通过对155例结直肠癌组织芯片信息进行基因富集分析,预测DNAJA1可能与E2F1转录因子调控相关,以及可能与细胞周期相关分子CDC45和CDK14相互作用。本文拟通过检测DNAJA1在结直肠癌中的表达,明确DNAJA1在结直肠癌中的生物学功能,探讨DNAJA1在结直肠癌增殖中的作用及信号通路,探讨靶向DNAJA1的小分子抑制剂KNK437在结直肠癌增殖中的效应,为DNAJA1作为新的结直肠癌分子标志物及药物靶点以及KNK437对抗结直肠癌增殖的应用前景提供科学依据,对于结直肠癌的诊断、预后判断、干预及药物研制均有重要科学意义。研究方法利用一系列体内外实验研究DNAJA1的生物学功能。利用Q-PCR和Western blot检测46对配对结直肠癌组织中DNAJA1的表达,利用免疫组化检测97例结直肠癌石蜡标本中DNAJA1的表达并用统计学方法分析其临床病理联系。利用双荧光素酶实验检测E2F1对DNAJA1启动子活性的影响;利用免疫共聚焦、CO-IP 和 GST pull-down 检测 DNAJA1 与 CDC45、CDK14 的相互作用。利用Q-PCR、Western blot、CCK8、平板克隆形成和皮下瘤实验检测靶向DNAJA1的小分子抑制剂KNK437的效率及效应。研究结果1、DNAJA1促进结直肠癌细胞的增殖:根据DNAJA1在7株结直肠癌细胞中的内源性表达,选择SW480和HCT116进行过表达DNAJA1,RKO和LOVO进行干扰DNAJA1;体外功能实验结果显示DNAJA1促进结直肠癌细胞的体外增殖能力;体内功能实验结果显示DNAJA1促进结直肠癌细胞的体内成瘤能力。Q-PCR和Western Blot检测配对结直肠癌组织中DNAJA1的表达情况,结果显示:DNAJA1在癌组织中表达明显高于正常黏膜组织;免疫组化检测97例结直肠癌石蜡切片中DNAJA1的表达情况并统计分析其临床病理联系,结果显示:DNAJA1在结直肠癌中表达上调,DNAJA1高表达与患者的不良预后相关。2、DNAJA1在转录因子E2F1调控下,通过直接结合并稳定CDC45和CDK14,促进细胞周期G1/S及S/G2期进展,从而促进结直肠癌细胞的增殖:结合生物信息学分析和一系列实验结果显示:转录因子E2F1促进DNAJA1的表达;DNAJA1直接结合CDC45、CDK14并稳定其表达。3、小分子抑制剂KNK437通过抑制DNAJA1,从而抑制结直肠癌的增殖:KNK437能明显下调DNAJA1的表达;KNK437在体内外均能发挥抗结直肠癌增殖的效应。结论(1)DNAJA1促进结直肠癌细胞的增殖能力,DNAJA1高表达与患者的不良预后相关;(2)DNAJA1在转录因子E2F1调控下,通过直接结合并稳定CDC45和CDK14的表达,促进细胞周期G1/S及S/G2期进展,从而促进结直肠癌细胞的增殖;(3)靶向DNAJA1的小分子抑制剂KNK437通过抑制DNAJA1的表达,从而抑制结直肠癌的增殖,提示DNAJA1可作为CRC治疗的药物靶点,以及KNK437作为抗结直肠癌药物的潜力。