检索结果-南通市图书馆

作者：金婷西南医科大学

学位级别：硕士

目的乳腺癌是女性最常见、多发的肿瘤,呈年轻化发展趋势,是女性恶性肿瘤中死亡率最高的疾病。DNAJ热休克蛋白40家族成员A1(DNAJ Heat Shock Protein 40 Family Member A1,dnaja1)基因是我们前期通过基因芯片技术筛选出来与肿瘤增殖、侵... 详细信息

目的乳腺癌是女性最常见、多发的肿瘤,呈年轻化发展趋势,是女性恶性肿瘤中死亡率最高的疾病。DNAJ热休克蛋白40家族成员A1(DNAJ Heat Shock Protein 40 Family Member A1,dnaja1)基因是我们前期通过基因芯片技术筛选出来与肿瘤增殖、侵袭和转移密切相关的基因,且分析TCGA,GTEx等数据库发现dnaja1在乳腺癌中高表达。p53蛋白,是一种关键的人类肿瘤抑制因子(Tumor Suppressor),多数人类癌症中发现了TP53抑癌基因突变,突变型p53的特异性稳定促进了肿瘤的发生和发展,且在多种肿瘤中发现其在化疗药物耐药中起作用。研究结果显示,在具有不同突变型p53的多种肿瘤细胞中敲除dnaja1能诱导C末端Hsc70反应蛋白(Cterminus of Hsc70-interacting protein,CHIP)泛素连接酶(Ubiquitin Ligase)介导的核浆转位,引起错误折叠的突变型p53的泛素化(Ubiquitin)和降解,而过表达dnaja1则能够阻碍甲戊酸途径(Mevalonate,MVA)介导的突变型p53的降解。本课题通过检测dnaja1在不同分子分型的乳腺癌中的表达,探讨dnaja1在乳腺癌中的生物学功能,进一步探讨dnaja1与突变型p53在乳腺癌增殖、转移及化疗抵抗(Chemotherapy Resistance)中的作用及可能的分子机制,为dnaja1是否能作为乳腺癌新的分子标志物及药物靶点提供科学依据,对于乳腺癌的诊断、药物治疗及预后具有重要科学依据。方法1.采用免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)技术检测不同分子亚型乳腺癌中dnaja1的表达情况,分析dnaja1在癌组织中的表达与p53突变及各临床病理参数的关系。在人乳腺癌细胞MDA-MB-231,HS578T中利用si RNA沉默dnaja1,利用生物学行为实验检测沉默dnaja1对其增殖、侵袭能力的影响。采用Western-blot检测沉默dnaja1对MDA-MB-231,HS578T细胞中上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal Transition,EMT)重要标记物E-cadherin,N-cadherin,Vimentin和干性相关标记物CD133,OCT4的影响。***检测40例接受相同方案新辅助化疗患者化疗之前穿刺标本癌组织中dnaja1的表达情况,分析dnaja1与化疗敏感性的关系。通过TCGA,GTEx数据库预测dnaja1与TP53的相关性及分析169例石蜡组织中dnaja1的表达与TP53的相关性。利用GSEA数据库预测dnaja1相关信号通路,并利用Western-blot检测TP53 R175H对信号通路的影响及利用CCK-8检测其对化疗效果的影响。结果***1在乳腺癌组织中的表达明显高于正常组织,在三阴性乳腺癌组织中的表达明显高于其它分子亚型的乳腺癌组织。dnaja1表达与p53的突变有关,P0.05。高表达dnaja1组患者的生存时间明显短于低表达组,Pdnaja1促进乳腺癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力,同时增强了细胞的干性及诱导EMT。***1在Miller-Payne 1级组乳腺癌组织中的表达最高,在Miller-Payne 5级组癌组织中表达最低。CCK-8实验结果显示干扰dnaja1增强了HS578T对多柔比星(Doxorubicin)的敏感性。4.在伴有p53突变的乳腺癌组织中dnaja1表达高于其在p53野生型中的表达,且dnaja1的表达与p53的表达呈正相关(R=0.1545,P=0.016)。GSEA数据库分析发现,dnaja1高表达存在K-RAS信号通路的富集。免疫共沉淀结果显示,与TP53 R273H,TP53 248W相比,dnaja1与TP53 R175H型存在直接结合。Western-blot结果显示,在HS578T中过表达TP53 R175H并干扰dnaja1,K-RAS信号通路关键蛋白K-RAS,p-ERK1/2,MAPK的表达水平均明显降低,而野生型p53中未观察到这种变化。在化疗药物多柔比星的作用下,TP53 R175H过表达的HS578T细胞增殖活性下降更慢,同时干扰dnaja1后,HS578T对多柔比星的敏感性增加。结论***1促进乳腺癌细胞的增殖和侵袭能力,dnaja1高表达与患者的不良预后及化疗抵抗有关。***1通过增强干性及诱导EMT增强乳腺癌细胞的增殖和侵袭能力。***1通过稳定TP53 R175H,

关键词： dnaja1 乳腺癌 TP53 增殖

来源：

同方学位论文库评论

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

dnaja1在胃癌中的表达情况及其对胃癌细胞生物学行为影响的初步探讨

DNAJA1在胃癌中的表达情况及其对胃癌细胞生物学行为影响的初步探...

引用

作者：周育儒西南医科大学

学位级别：硕士

目的:胃癌是全球高发恶性肿瘤之一,在中国胃癌新发病率及致死率均位居恶性肿瘤第三位,严重危害人类身体健康。热休克蛋白(heat shock proteins,HSPs)是调控细胞生命的不可或缺的关键蛋白,同时也参与多种肿瘤发生、发作的调控。DNAJ热休... 详细信息

目的:胃癌是全球高发恶性肿瘤之一,在中国胃癌新发病率及致死率均位居恶性肿瘤第三位,严重危害人类身体健康。热休克蛋白(heat shock proteins,HSPs)是调控细胞生命的不可或缺的关键蛋白,同时也参与多种肿瘤发生、发作的调控。DNAJ热休克蛋白40家族成员A1(DNAJ heat shock protein 40 family member A1,dnaja1)是课题组前期筛选出的与肿瘤发生、进展紧密相关的基因,但其在不同肿瘤中扮演着不同角色。本课题组前期利用公共生物数据库分析发现dnaja1在胃癌中可能表达上调,但其在胃癌中的具体表达情况及机制并不明确。本研究拟检测dnaja1在胃癌石蜡组织中的表达情况并分析其与临床病理特征的相关关系,初步探讨dnaja1对胃癌细胞生物学行为的影响。为dnaja1成为新的胃癌分子生物标记奠定基础,为胃癌的诊断、预后评估以及药物治疗提供新的研究靶点。方法:1.利用免疫组化检测胃癌组织、癌旁正常胃黏膜、淋巴结转移病灶中dnaja1的表达水平,并且通过统计学方法分析其与临床病理特征的相关关系。2.利用Real-time PCR及Western blot分别检测4株人胃癌细胞株中dnaja1表达水平。3.采用小干扰RNA和慢病毒质粒分别瞬时转染构建dnaja1干扰胃癌细胞株和dnaja1过表达胃癌细胞株。4.通过MTT、平板克隆形成实验、Transwell和划痕实验研究dnaja1对胃癌细胞生物学行为的影响。结果:1.免疫组化检测结果表明,与癌旁正常的胃黏膜相比,胃癌组织和淋巴结转移病灶中dnaja1的表达水平显著上调。但将胃癌原发病灶与淋巴结转移病灶相比较分析,发现两者中dnaja1表达差异无统计学意义。此外,胃癌组织中dnaja1的高表达与淋巴结转移、p53突变、HER-2状态、浸润深度及WHO分型(P0.05)。高表达dnaja1组的患者比低表达dnaja1组的患者5年生存率明显降低(P1促进胃癌细胞的增殖、侵袭能力。根据dnaja1在4株胃癌细胞中的内源性表达情况,选择HGC-27细胞株过表达dnaja1,AGS细胞株干扰dnaja1。MTT实验和平板克隆形成实验结果表明过表达dnaja1促进胃癌细胞的体外增殖能力(Pdnaja1促进胃癌细胞的体外侵袭能力(Pdnaja1促进胃癌细胞的体外迁移能力(P1在胃癌和淋巴结转移灶中的表达明显高于正常胃黏膜组织。***1高表达与胃癌淋巴结转移、p53状态、HER-2状态、浸润深度及WHO分型相关。3.高表达dnaja1与胃癌患者不良预后有关。4.过表达dnaja1促进胃癌细胞的增殖、侵袭以及迁移能力。

关键词： dnaja1 胃肿瘤增殖侵袭

来源：

同方学位论文库评论

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

dnaja1调控结直肠癌增殖的作用及其分子机制

DNAJA1调控结直肠癌增殖的作用及其分子机制

引用

作者：杨少珊南方医科大学

学位级别：硕士

研究背景和目的结直肠癌是世界上第三大最常见的肿瘤、第四大致死性的肿瘤,每年约有1,361,000人被确诊为结直肠癌,并且每年约有694,000名患者的死因是结直肠癌[1]。结直肠癌转移是影响结直肠癌患者疗效和死亡的重要因素。因此阐明结直... 详细信息

研究背景和目的结直肠癌是世界上第三大最常见的肿瘤、第四大致死性的肿瘤,每年约有1,361,000人被确诊为结直肠癌,并且每年约有694,000名患者的死因是结直肠癌[1]。结直肠癌转移是影响结直肠癌患者疗效和死亡的重要因素。因此阐明结直肠癌发生、发展的分子机制,仍是目前研究的重要方向。DnaJ Heat Shock Protein Family Member A1(dnaja1)是本课题组前期通过原位杂交筛选出来的FMNL2相互作用蛋白,是热休克蛋白家族(Heatshock proteins,HSPs)下的分子伴侣家族HSP40的成员之一,其特征是具有一个高度保守的氨基酸端J结构域。近几年的研究结果显示,HSPs蛋白与肿瘤细胞的增殖、侵袭、分化、转移及死亡都有密切关系。通过对155例结直肠癌组织芯片信息进行基因富集分析,预测dnaja1可能与E2F1转录因子调控相关,以及可能与细胞周期相关分子CDC45和CDK14相互作用。本文拟通过检测dnaja1在结直肠癌中的表达,明确dnaja1在结直肠癌中的生物学功能,探讨dnaja1在结直肠癌增殖中的作用及信号通路,探讨靶向dnaja1的小分子抑制剂KNK437在结直肠癌增殖中的效应,为dnaja1作为新的结直肠癌分子标志物及药物靶点以及KNK437对抗结直肠癌增殖的应用前景提供科学依据,对于结直肠癌的诊断、预后判断、干预及药物研制均有重要科学意义。研究方法利用一系列体内外实验研究dnaja1的生物学功能。利用Q-PCR和Western blot检测46对配对结直肠癌组织中dnaja1的表达,利用免疫组化检测97例结直肠癌石蜡标本中dnaja1的表达并用统计学方法分析其临床病理联系。利用双荧光素酶实验检测E2F1对dnaja1启动子活性的影响;利用免疫共聚焦、CO-IP 和 GST pull-down 检测 dnaja1 与 CDC45、CDK14 的相互作用。利用Q-PCR、Western blot、CCK8、平板克隆形成和皮下瘤实验检测靶向dnaja1的小分子抑制剂KNK437的效率及效应。研究结果1、dnaja1促进结直肠癌细胞的增殖:根据dnaja1在7株结直肠癌细胞中的内源性表达,选择SW480和HCT116进行过表达dnaja1,RKO和LOVO进行干扰dnaja1;体外功能实验结果显示dnaja1促进结直肠癌细胞的体外增殖能力;体内功能实验结果显示dnaja1促进结直肠癌细胞的体内成瘤能力。Q-PCR和Western Blot检测配对结直肠癌组织中dnaja1的表达情况,结果显示:dnaja1在癌组织中表达明显高于正常黏膜组织;免疫组化检测97例结直肠癌石蜡切片中dnaja1的表达情况并统计分析其临床病理联系,结果显示:dnaja1在结直肠癌中表达上调,dnaja1高表达与患者的不良预后相关。2、dnaja1在转录因子E2F1调控下,通过直接结合并稳定CDC45和CDK14,促进细胞周期G1/S及S/G2期进展,从而促进结直肠癌细胞的增殖:结合生物信息学分析和一系列实验结果显示:转录因子E2F1促进dnaja1的表达;dnaja1直接结合CDC45、CDK14并稳定其表达。3、小分子抑制剂KNK437通过抑制dnaja1,从而抑制结直肠癌的增殖:KNK437能明显下调dnaja1的表达;KNK437在体内外均能发挥抗结直肠癌增殖的效应。结论(1)dnaja1促进结直肠癌细胞的增殖能力,dnaja1高表达与患者的不良预后相关;(2)dnaja1在转录因子E2F1调控下,通过直接结合并稳定CDC45和CDK14的表达,促进细胞周期G1/S及S/G2期进展,从而促进结直肠癌细胞的增殖;(3)靶向dnaja1的小分子抑制剂KNK437通过抑制dnaja1的表达,从而抑制结直肠癌的增殖,提示dnaja1可作为CRC治疗的药物靶点,以及KNK437作为抗结直肠癌药物的潜力。

关键词： dnaja1 结直肠癌增殖

来源：

同方学位论文库评论

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

胃癌中dnaja1的表达及其对胃癌细胞生物学行为的影响

引用

临床与实验病理学杂志 2023年第5期39卷 525-530页

作者：周育儒吴娇罗雨豪任小莉王舰梅西南医科大学附属医院病理科泸州646000 西南医科大学附属医院肿瘤科泸州646000

目的探讨DNAJ热休克蛋白40家族成员A1(dnaja1)在胃癌中的表达、临床病理特征及其对胃癌细胞生物学行为的影响。方法采用免疫组化PV两步法检测160例胃癌石蜡组织中dnaja1的表达;应用Western blot及RT-PCR检测胃癌细胞中dnaja1表达水平;运... 详细信息

目的探讨DNAJ热休克蛋白40家族成员A1(dnaja1)在胃癌中的表达、临床病理特征及其对胃癌细胞生物学行为的影响。方法采用免疫组化PV两步法检测160例胃癌石蜡组织中dnaja1的表达;应用Western blot及RT-PCR检测胃癌细胞中dnaja1表达水平;运用MTT、Transwell侵袭实验检测dnaja1对胃癌细胞增殖和侵袭能力的影响。结果dnaja1在胃癌组织中高表达率为69.37%,高于癌旁正常胃组织(44.37%,P1)。临床病理特征分析发现,dnaja1高表达与淋巴结转移(P=0.019)、p53状态(P=0.003)、HER-2状态(P=0.001)、浸润深度(P=0.035)及WHO分型(P=0.008)相关。体外实验证实,过表达dnaja1促进胃癌细胞增殖和侵袭(MTT MOCK组:0.45±0.02,dnaja1组:0.74±0,Pdnaja1组:144.33±9.50,P1);干扰dnaja1抑制胃癌细胞增殖和侵袭(MTT NC组:0.92±0.02,siRNA1组:0.69±0.08,siRNA2组:0.74±0.03,P132.66±4.16,siRNA1组:26.00±3.60,siRNA2组:38.00±5.29,P1)。结论dnaja1促进胃癌细胞增殖和侵袭,其在胃癌中高表达与肿瘤TNM分期、预后有关,可作为预测胃癌患者肿瘤分期及预后的生物学标志物。

关键词：胃肿瘤 dnaja1 增殖侵袭

来源：

维普期刊数据库

同方期刊数据库评论

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

高表达dnaja1促进乳腺癌细胞增殖及侵袭且与患者的不良预后及化疗抵抗密切相关

引用

现代肿瘤医学 2022年第11期30卷 1983-1989页

作者：金婷任小莉杨巧周育儒王舰梅龙汉安西南医科大学临床医学院四川泸州646000 西南医科大学附属医院病理科四川泸州646000

目的:分析DNAJ热休克蛋白40家族成员A1[DNAJ heat shock protein 40 family(Hsp40)member A1,dnaja1]在人乳腺癌组织中的表达及其与患者临床病理特征的关系,探讨dnaja1对乳腺癌细胞增殖及侵袭的影响,揭示其与乳腺癌患者预后及化疗抵抗... 详细信息

目的:分析DNAJ热休克蛋白40家族成员A1[DNAJ heat shock protein 40 family(Hsp40)member A1,dnaja1]在人乳腺癌组织中的表达及其与患者临床病理特征的关系,探讨dnaja1对乳腺癌细胞增殖及侵袭的影响,揭示其与乳腺癌患者预后及化疗抵抗的关系。方法:免疫组织化学检测169例乳腺癌患者配对石蜡组织及120例接受新辅助化疗前穿刺活检石蜡组织中dnaja1的表达情况。CCK-8、平板克隆、Transwell侵袭及细胞划痕实验检测dnaja1对乳腺癌细胞增殖和侵袭的影响。结果:dnaja1在原发灶及转移灶的乳腺癌组织中的表达明显高于癌旁组织(P1,P1)。临床病理分析发现,dnaja1的高表达与分子分型、p53的突变和肿瘤复发密切相关。dnaja1高表达还与患者的较短生存时间相关(P=0.023)。另外,dnaja1在接受新辅助化疗的Miller-Payne(MP)5级组患者的癌组织中表达明显低于其他组(P=0.0004)。体外实验证实,敲低dnaja1能明显抑制乳腺癌细胞的增殖和侵袭。结论:dnaja1能促进乳腺癌细胞的增殖和侵袭,且dnaja1在乳腺癌组织中高表达与患者不良预后及化疗抵抗相关,可作为预测患者预后及新辅助化疗效果的一个新靶点。

关键词：乳腺癌 dnaja1 p53 化疗抵抗

来源：

维普期刊数据库

同方期刊数据库评论

在线全文

学校读者我要写书评

暂无评论

宿主细胞蛋白dnaja1及dnaja2对JEV增殖的影响及其机制研究

宿主细胞蛋白DnaJA1及DnaJA2对JEV增殖的影响及其机制研究

引用

作者：饶婷婷华中农业大学

学位级别：硕士

乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)是一种危害严重的人畜共患虫媒性病毒病病原。JEV感染严重威胁人类健康,引起脑部炎症和神经损伤;也危害养猪业发展,引起猪的繁殖障碍疾病,但其致病机制尚不清楚。近年研究显示,乙脑病毒... 详细信息

乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus,JEV)是一种危害严重的人畜共患虫媒性病毒病病原。JEV感染严重威胁人类健康,引起脑部炎症和神经损伤;也危害养猪业发展,引起猪的繁殖障碍疾病,但其致病机制尚不清楚。近年研究显示,乙脑病毒蛋白与宿主蛋白间的相互作用对病毒吸附、基因组合成、病毒粒子组装与释放、天然免疫逃逸及诱导宿主机体保护性免疫等方面产生重要影响。JEV非结构蛋白NS3由Ser蛋白酶结构域和NTPase/RNA解旋酶结构域构成,具有三种酶活性,在病毒RNA复制、病毒粒子组装与释放及病毒致病性中发挥重要作用,是一个多功能蛋白。因此,研究NS3蛋白与宿主蛋白的相互作用对解析JEV复制和致病机制及开发抗病毒药物具有重要的科学意义。本研究主要围绕与NS3互作宿主蛋白的筛选与鉴定、宿主蛋白对JEV增殖的影响及分子机制的研究展开,具体内容如下:*** NS3蛋白相互作用宿主蛋白的筛选为了研究与JEV NS3相互作用的宿主蛋白,将JEV RP9毒株NS3基因序列克隆入慢病毒表达载体获得重组质粒p TRIP-NS3-3Flag,该质粒和p TRIP-3Flag分别与辅助质粒共转染293T细胞,获得表达NS3慢病毒。将慢病毒转导293T细胞,构建稳定表达NS3细胞系293T-NS3。进而利用免疫沉淀(IP)结合质谱分析(LC-MS/MS)的方法筛选与NS3互作宿主蛋白,根据质谱分析结果,我们选取HSP40/Dna JA1、HSP40/Dna JA2和CKB展开研究。为了鉴定NS3与三个候选蛋白相互作用,进而构建了真核表达质粒HA-Dna JA1、HA-Dna JA2和HA-CKB,分别与p TRIP-NS3-3Flag共转染293T细胞。免疫共沉淀(Co-IP)和Western blot检测结果显示NS3与Dna JA1和Dna JA2发生相互作用,而不能与CKB互作。为了进一步确定Dna JA1及Dna JA2与NS3互作功能域,分别构建了Dna JA1和Dna JA2的截短突变体,将p TRIP-NS3-3Flag与截短体的表达质粒共转染293T细胞,30h后收集细胞样品进行Co-IP分析,结果显示NS3能够钓取全长Dna JA2和C端截短体。Dna JA1的结果与Dna JA2一致,表明Dna JA1和Dna JA2的C端结构域参与了与NS3的相互作用。*** JA1及Dna JA2对JEV增殖的影响将Dna JA1及Dna JA2克隆入p TRIP-3Flag获得p TRIP-Dna JA1-3Flag和p TRIP-Dna JA2-3Flag,转染293T细胞24h后感染JEV(RP9,1MOI),36h后收集细胞和培养上清液。通过Wetsern blot、RT-q PCR和病毒噬斑实验评价Dna JA1及Dna JA2对JEV增殖的影响。Western blot检测结果显示Dna JA2的表达能显著提高NS3的蛋白水平;RT-q PCR统计结果表明Dna JA2的表达组中JEV C基因拷贝数显著高于对照组(p1);病毒噬斑统计结果表明过表达Dna JA2的细胞中JEV的病毒滴度显著增高(p1)。同时,Dna JA2对JEV增殖的促进作用呈剂量依赖效应。Dna JA1对JEV增殖的促进效应与Dna JA2表现一致。为了进一步确认Dna JA1和Dna JA2对JEV增殖的影响,利用慢病毒干扰系统获得稳定干扰Dna JA1或Dna JA2表达的293T细胞系。进而用1MOI的JEV感染,36h后收集细胞与上清,通过Wetsern blot、实时定量PCR和病毒噬斑法评价下调表达Dna JA1及Dna JA2后对JEV增殖的影响。结果显示,内源性蛋白Dna JA1与Dna JA2表达下调后,病毒蛋白NS3水平,C基因m RNA水平及病毒滴度均显著下降,与过表达Dna JA1和Dna JA2结果相反。进一步证实了Dna JA1和Dna JA2可以促进JEV增殖。*** JA1及Dna JA2促进JEV增殖的分子机制NS3与NS5相互作用共同参与JEV复制复合体的形成,在JEV复制中发挥重要作用。本研究证实了Dna JA1和Dna JA2与NS3相互作用并促进JEV增殖。那么Dna JA1和Dna JA2与NS5是否也存在相互作用呢?通过正反向免疫共沉淀实验证实了Dna JA1和Dna JA2能与外源性NS5以及JEV感染293T细胞产生的内源性NS3和NS5发生相互作用。间接免疫荧光及激光共聚焦显微镜观察也证实Dna JA1及Dna JA2与病毒蛋白NS3、NS5及病毒基因组RNA(ds RNA)存在共定位。这些结果表明Dna JA1和Dna JA2可能参与JEV复制复合体的形成。

关键词：乙型脑炎病毒非结构蛋白NS3 蛋白互作 dnaja1 dnaja2 促进病毒增殖

来源：

同方学位论文库评论

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

基于CRISPR/Cas9文库筛选的dnaja1调控蛋白质稳态在热应激损伤中的机制研究

基于CRISPR/Cas9文库筛选的DNAJA1调控蛋白质稳态在热应激损伤中...

引用

作者：王少康中国人民解放军海军军医大学

学位级别：硕士

研究背景与目的热射病是一种高温引起的致命性疾病,以核心温度显著升高和中枢神经系统功能障碍为典型特征。热射病发病后进展迅速,常伴有多器官功能损伤,然而目前尚无特异性药物治疗。因此,深入研究热射病的发病机制并提高易感人群的热... 详细信息

研究背景与目的热射病是一种高温引起的致命性疾病,以核心温度显著升高和中枢神经系统功能障碍为典型特征。热射病发病后进展迅速,常伴有多器官功能损伤,然而目前尚无特异性药物治疗。因此,深入研究热射病的发病机制并提高易感人群的热耐受能力至关重要。我们课题组基于CRISPR/Cas9文库筛选的方法,对人脐静脉内皮细胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVEC)进行了耐热基因的筛选工作。我们通过循环热应激处理最终筛选出dnaja1基因,进一步研究表明dnaja1基因敲除具有显著改善HUVEC热损伤作用。细胞暴露于高温环境下可引起错误折叠蛋白增多,从而导致细胞内的蛋白质稳态失衡。为维持蛋白稳态从而保证细胞正常功能,细胞通过复杂的机制网络来应对热应激,例如:热休克反应,泛素-蛋白酶体途径,自噬,以及未折叠蛋白反应。dnaja1是热休克蛋白40(heat shock proteins 40,HSP40)家族成员,参与热休克反应,而dnaja1在热应激中的作用及具体机制少有文献报道。因此,本课题旨在明确基于CRISPR/Cas9文库筛选出的dnaja1基因敲除增加细胞热耐受能力的具体作用,探究dnaja1在热应激时对细胞蛋白质稳态的调控机制,以期为热射病的防治与热耐受能力的提高提供新的研究方向及药物靶点。研究方法(一)基于CRISPR/Cas9文库筛选技术进行耐热基因的筛选1、将HUVEC分别在43 C,5%CO条件下培养不同时间(1h,2h,4h),然后在37C孵育不同时间(0h,3h,6h、24h),并使用CCK-8法检测细胞活力,明确细胞热损伤;2、利用CRISPR/Cas9 sg RNA敲除文库与循环热应激的方法筛选耐热基因。(二)dnaja1敲除保护细胞热损伤表型的验证1、慢病毒转染构建dnaja1敲除的稳转株细胞;2、使用CCK-8法检测dnaja1敲除对细胞增殖的影响;3、利用CCK-8法及电镜观察明确dnaja1在HUVEC细胞热应激损伤中的作用;并在多种细胞中重复验证。4、对dnaja1点突变完成对dnaja1不同结构域的失活,CCK-8法比较dnaja1几种截断体对热应激后细胞活性的影响。(三)探究dnaja1保护细胞热损伤的潜在机制1、ANS探针法检测dnaja1敲除对热应激中错误折叠蛋白产生与聚集的影响;2、蛋白质印迹法(Western blot,WB)检测dnaja1敲除对热应激细胞热休克蛋白家族表达的影响;3、WB检测自噬相关蛋白,并使用自噬抑制剂验证自噬在dnaja1敲除改善热损伤中的潜在作用;4、使用蛋白酶体抑制剂MG132干预,探索泛素-蛋白酶体途径在热应激野生型与dnaja1敲除细胞中的作用;(四)探究dnaja1基因敲除对热射病致小鼠多器官损伤及生存率的影响1、构建dnaja1基因敲除小鼠;2、建立小鼠热射病模型;3、监测小鼠核心体温、不同时间点血生化指标、各脏器病理变化、记录并分析生存率。实验结果(一)基于CRISPR/Cas9文库筛选技术成功筛选出耐热基因1、通过探索不同热应激条件对细胞活性的影响,确定出后续耐热基因筛选及机制研究的热处理条件为热应激4h恢复6h;2、通过CRISPR/Cas9 sg RNA敲除文库筛选出三株“耐热细胞”系,结果显示“耐热细胞”系中针对dnaja1设计的g RNA序列的丰度最高,即“耐热细胞”系中dnaja1敲除的细胞含量最丰富。(二)dnaja1基因敲除改善细胞热损伤1、通过慢病毒转染成功构建dnaja1敲除稳转株细胞;2、细胞活力的检测结果及电镜结果均显示dnaja1敲除显著改善了细胞热应激损伤;3、dnaja1各结构域敲除的截断体均得到了dnaja1全敲相同的效应。(三)热应激时dnaja1参与调控蛋白质稳态1、dnaja1敲除通过延长HSF1入核时间,提高基础水平与热应激时热休克蛋白家族的表达;2、HUVEC在热应激时,自噬小体形成增多,自噬流活化;而dnaja1敲除使HUVEC热应激后的自噬流阻滞;3、dnaja1敲除增加热应激时细胞内K48位点泛素化水平,抑制蛋白酶体功能消除了dnaja1敲除改善热损伤的效应;4、dnaja1敲除通过以上机制,减少热应激导致细胞内错误折叠蛋白的产生与聚集,维持细胞内蛋白质稳态;(四)dnaja1敲除改善热射病小鼠的器官功能损伤及生存率1、在动物水平上,我们以稳定的环境温湿度(40 C,60%相对湿度)与固定的加热时间(3h)成功构建小鼠经典型热射病模型,小鼠加热后血生化损伤指标升高显著,病理损伤严重,死亡率较高。2、dnaja1敲除显著改善了热射病小鼠各脏器血生化损伤的指标,减轻病理损伤,并且改善小鼠热射病的生存率。结论dnaja1敲除具有增强细胞耐热能力的潜在作用,其保护机制可能

关键词：热射病热应激 dnaja1 错误折叠蛋白泛素-蛋白酶体

来源：

同方学位论文库评论

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

基于邻近标记技术TurboID寻找AMPK的互作蛋白

基于邻近标记技术TurboID寻找AMPK的互作蛋白

引用

作者：郭媛媛湖北科技学院

学位级别：硕士

目的:单磷酸腺苷激动的蛋白激酶(AMPK),其活性受机体内AMP/ATP比值的调节,是控制细胞能量代谢的重要中枢,也是一种进化上保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。AMPK在糖尿病、心肌梗塞及许多疾病中发挥重要的功能,我们试图利用TurboID技术研究... 详细信息

目的:单磷酸腺苷激动的蛋白激酶(AMPK),其活性受机体内AMP/ATP比值的调节,是控制细胞能量代谢的重要中枢,也是一种进化上保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。AMPK在糖尿病、心肌梗塞及许多疾病中发挥重要的功能,我们试图利用TurboID技术研究可与AMPK互作的新颖蛋白,并探究该蛋白所发挥的生物学功能,以期为新的靶向药物开发提供理论依据。方法:我们将采用慢病毒感染技术将AMPK-TurboID融合基因转染到星形胶质细胞U251中,构建AMPK过表达稳转细胞系。经过生物素标记6 h后,再通过银染色法可观察到大量与AMPK相互作用的蛋白。采用label-free定量蛋白质谱分析其互作蛋白,并选择互作蛋白dnaja1进行IP和免疫荧光验证。结果:成功构建AMPK-TurboID过表达稳转细胞系,经过生物素标记实验后得到大量互作蛋白,再通过质谱分析得到所有互作蛋白信息,并选择互作蛋白dnaja1进行IP和免疫荧光验证。此外,我们发现AMPK和dnaja1可以共同参与细胞抗凋亡。结论:因AMPK参与多种代谢通路,加之TurboID邻近标记技术的催化活性高,标记快的优势,通过生物素标记实验找到大量与AMPK基因相互作用的蛋白质,且后续通过实验验证AMPK和dnaja1具有相互作用,两者可以协同保护细胞免于凋亡;对未来如何运用AMPK治疗糖尿病和心肌梗塞等临床疾病奠定了一定理论基础。

关键词： TurboID AMPK dnaja1 银染稳转细胞系

来源：

同方学位论文库评论

在线全文

同方学位论文库

学校读者我要写书评

暂无评论

欢迎您,

建议与咨询留下您的常用邮箱和电话号码，以便我们向您反馈解决方案和替代方法

时间限定

文献类型

馆藏选择

核心期刊

语言

文献类型

帮助

文字说明：

检索规则说明：

检索范例：

分类表

所选分类

限定检索结果

文献类型

馆藏范围

日期分布

学科分类号

主题

机构

作者

语言

在线全文

在线全文

在线全文

在线全文

在线全文

在线全文

在线全文

在线全文

请选择保存的检索档案：

请选择收藏分类：

通借通还

欢迎您,

建议与咨询 留下您的常用邮箱和电话号码，以便我们向您反馈解决方案和替代方法

时间限定

文献类型

馆藏选择

核心期刊

语言

文献类型

帮助

文字说明：

检索规则说明：

检索范例：

分类表

所选分类

限定检索结果

文献类型

馆藏范围

日期分布

学科分类号

主题

机构

作者

语言

在线全文

在线全文

在线全文

在线全文

在线全文

在线全文

在线全文

在线全文

请选择保存的检索档案： 新增检索档案 确定 取消

请选择收藏分类： 新增自定义分类 确定 取消

通借通还

建议与咨询留下您的常用邮箱和电话号码，以便我们向您反馈解决方案和替代方法

请选择保存的检索档案：

请选择收藏分类：