LncRNA-9560和LncRNA-9606调节猪流行性腹泻病毒复制的研究

作     者：燕苗苗 

作者单位：中国农业科学院 

学位级别：硕士

导师姓名：刘光亮

授予年度：2020年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：猪流行性腹泻病毒 LncRNA 病毒复制 GM-CSF 

摘      要：长链非编码RNA（lncRNA）是一类具有多种功能的RNA分子,参与调控机体的生命活动。近期研究结果显示,在病毒感染的组织或细胞中lncRNA差异表达。目前,有关人类的lncRNA研究较多,而在动物体上的研究相对较少。本研究旨在分析猪流行性腹泻病毒（PEDV）感染宿主细胞后lncRNA表达谱的变化以及差异表达的lncRNA对PEDV及宿主的调节功能。首先,为探究PEDV感染是否影响宿主lncRNA的表达水平,本研究对感染PEDV的猪小肠上皮细胞（IPEC-J2细胞）样本进行转录组测序及生物信息学分析,分析结果表明,PEDV可诱导IPEC-J2细胞中的lncRNA发生差异表达,且其表达水平随PEDV感染时间推移呈现不同倍数的增多或减少;采用基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）对差异表达的lncRNA进行功能富集,发现在PEDV感染后的不同时间点宿主lncRNA所富集的信号通路不尽相同,这表明宿主的主要生命过程随病毒感染的时间推移呈现动态变化。通过靶基因预测,发现lncRNA-9560和lncRNA-9606靶向同一个转录本,而该转录本编码的蛋白质与IgA生成密切相关。随后,进一步分析了这两条lncRNA的基本特征,发现lncRNA-9560和lncRNA-9606在IPEC-J2细胞中的含量随PEDV感染时间的推移逐渐增多,并在60 h时达到峰值,随后开始降低。通过核质分离qPCR方法确定lncRNA-9560和lncRNA-9606的亚细胞定位,结果表明,这两条lncRNA在细胞核和细胞质中均有分布,但主要分布于细胞核中。为验证lncRNA-9560和lncRNA-9606确为非编码RNA,本研究将His标签编码基因分别融合至这两条lncRNA及其突变体的3’端,将重组质粒分别转染至HEK-293T细胞并分析重组质粒能否翻译蛋白质,结果表明,lncRNA-9560和lncRNA-9606均为不编码蛋白质的非编码RNA。为探究lncRNA-9560和lncRNA-9606对PEDV复制的影响,本研究采用实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹分析在lncRNA过表达的LLC-PK1细胞中PEDV的复制能力及N蛋白表达量的变化,结果表明,lncRNA-9560和lncRNA-9606均能抑制PEDV的复制。为进一步探究lncRNA-9560和lncRNA-9606是否在转录水平调节细胞因子的表达,本研究采用实时荧光定量PCR检测lncRNA过表达或缺失的IPEC-J2细胞中细胞因子表达变化,结果表明,过表达lncRNA-9606能在mRNA水平促进GM-CSF的转录,反之亦然;然而,lncRNA-9560未能影响肿瘤坏死因子?（TNF-?）和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）等细胞因子在mRNA水平的转录。综上所述,本研究全面分析了PEDV感染过程中IPEC-J2细胞中lncRNA表达谱的变化,并发现lncRNA-9560和lncRNA-9606可抑制PEDV的病毒复制,其中lncRNA-9606可促进GM-CSF mRNA的转录。该研究丰富了lncRNA调控病毒感染的知识库,也为以lncRNA作为药物靶标用于PEDV治疗提供了新思路和理论基础。