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RNA m^(5)C修饰调控病毒复制的研究进展

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科学通报 2022年第31期67卷 3654-3666页

作者：张婷王紫凌郑永唐中国科学院昆明动物研究所中国科学院动物模型与人类疾病机理重点实验室昆明650223 中国科学技术大学生命科学学院合肥230026

5-甲基胞嘧啶(5-methylcytosine,m^(5)C)作为一类重要的转录后修饰形式,在真核生物信使RNA(messenger RNA,mRNA)、转运RNA(transfer RNA,tRNA)和核糖体RNA(ribosomal RNA,rRNA)上普遍存在,并且参与调控RNA出核、翻译和稳定性维持等代谢加工过程.该修饰是动态可逆的,由甲基转移酶(methyltransferases)催化生成,并由去甲基化酶(demethylases)移除,通过招募特定的识别蛋白(reader proteins,readers)参与调控胚胎发育、肿瘤发展和干细胞分化等生理及病理过程.近期研究表明,除真核生物RNA外,病毒RNA上同样富含m^(5)C修饰,并且在转录、剪切和翻译等复制阶段扮演重要角色.此外,病毒感染可诱发宿主RNA的m^(5)C修饰改变,从而影响宿主对病毒感染的应答反应.随着RNA m^(5)C修饰测序技术的快速发展,病毒m^(5)C修饰的相关报道大量涌现,然而m^(5)C修饰在病毒感染中的具体调控机制至今尚未完全阐明.本文综述了近年来RNA m^(5)C修饰在逆转录病毒(retrovirus)、DNA病毒(DNA virus)、黄病毒(flavivirus)和冠状病毒(coronavirus)复制,以及宿主抗病毒免疫应答中的调控作用和分子机制,旨在为病毒表观遗传学研究提供参考.

关键词： 5-甲基胞嘧啶甲基转移酶去甲基化酶识别蛋白病毒复制宿主抗病毒免疫反应

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NMRAL1对流感病毒复制的调控机制

中国农业科学 2022年第10期55卷 2067-2076页

作者：严娅王广文孔凡迪王旭远王一涵李俊平赵玉辉李呈军陈化兰姜丽中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/兽医生物技术国家重点实验室

【目的】流感病毒是一种人兽共患病原，常引起大流行，给人类健康造成巨大威胁，且流感病毒易发生变异，能不断逃逸宿主细胞的免疫反应，对现有抗流感药物产生耐药性，因此寻找抵抗流感的新方法迫在眉睫。研究通过探索NMRAL1(NmrA-like ... 详细信息

【目的】流感病毒是一种人兽共患病原，常引起大流行，给人类健康造成巨大威胁，且流感病毒易发生变异，能不断逃逸宿主细胞的免疫反应，对现有抗流感药物产生耐药性，因此寻找抵抗流感的新方法迫在眉睫。研究通过探索NMRAL1(NmrA-like family domain-containing protein 1)对流感病毒复制的影响，并揭示其发挥作用的分子机制，为抗流感药物研发提供潜在靶点。【方法】采用siRNA干扰技术在A549细胞中下调表达NMRAL1，并通过Western Blot检测siRNA干扰后NMRAL1的表达水平；在下调表达NMRAL1的细胞中，分别感染A/Anhui/2/2005 (AH05)(H5N1)和A/WSN/33 (H1N1)两株不同亚型流感病毒，利用蚀斑试验检测感染病毒后24和48 h细胞上清中的病毒滴度。为确定NMRAL1影响流感病毒复制的具体阶段，在HEK293T细胞中瞬时转染NMRAL1-Myc-pCAGGS质粒过表达NMRAL1，通过双荧光素酶报告系统检测过表达NMRAL1对流感病毒聚合酶活性的影响；使用免疫荧光技术对流感病毒NP蛋白进行染色，通过激光共聚焦试验观察下调表达NMRAL1对感染病毒后3、4、5、6和8 h NP蛋白在被感染细胞中的定位情况的影响，判断下调表达NMRAL1是否影响流感病毒的入核和出核过程；利用Western Blot检测下调表达NMRAL1对流感病毒各病毒蛋白表达的影响和对流感病毒激活I型干扰素通路下游IFN刺激基因（ISGs）表达的影响，利用间接免疫荧光试验进一步研究NMRAL1对流感病毒复制的影响。【结果】Western Blot检测发现NMRAL1 siRNA能显著下调NMRAL1表达，在下调表达NMRAL1的A549细胞中分别感染H5N1和H1N1病毒，并通过蚀斑试验检测感染病毒后细胞上清中的病毒滴度，结果显示在下调表达NMRAL1的细胞中，感染流感病毒后24和48 h收取的细胞上清中病毒滴度显著下降，表明NMRAL1能促进不同亚型流感病毒的复制；为进一步探索NMRAL1调控流感病毒复制的具体机制，利用双荧光素酶报告系统检测流感病毒聚合酶活性，发现过表达NMRAL1对流感病毒聚合酶活性无明显影响；激光共聚焦试验结果显示下调NMRAL1表达不影响NP蛋白的入核和出核过程，同时Western Blot检测表明下调NMRAL1表达不影响各病毒蛋白的表达；但荧光定量PCR试验结果显示下调NMRAL1表达能够促进流感病毒感染诱导的IFN-β mRNA水平上升，且Western Blot检测发现下调表达NMRAL1促进I型干扰素通路下游的MxA和IFITM3抗病毒蛋白的表达，与此同时，间接免疫荧光试验结果显示下调NMRAL1表达可显著抑制流感病毒复制。【结论】在流感病毒感染过程中，NMRAL1不影响流感病毒的入侵以及转录翻译过程，而是通过抑制I型干扰素通路激活从而抑制MxA、IFITM3等抗病毒因子的表达，最终促进流感病毒复制。研究证实宿主因子NMRAL1正调控流感病毒的复制，丰富了参与流感病毒复制的宿主因子网络。

关键词： NMRAL1 流感病毒病毒复制 IFN-β 抗病毒基因

IRES核心区12-bp非连续插入突变对猪塞内卡病毒复制和细胞嗜性的影响

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中国农业科学 2024年第7期57卷 1407-1416页

作者：张晓战董轩志吕楠楠刘懿雯马新甜王林青夏艳勋蒋增海郭运泽赵攀登宋予震杨德成边传周河南牧业经济学院动物医药学院郑州师范学院/分子生物学郑州市重点实验室中国农业科学院哈尔滨兽医研究所/动物疫病防控全国重点实验室

【背景】塞内卡病毒（senecavirus A, SVA）是新近暴发的一种引起猪特发性水疱病及仔猪死亡的小核糖核酸病毒。该病毒基因组5′非编码区（untranslated region, UTR）中的内部核糖体进入位点（IRES）元件在病毒复制过程中发挥重要作用。... 详细信息

【背景】塞内卡病毒（senecavirus A, SVA）是新近暴发的一种引起猪特发性水疱病及仔猪死亡的小核糖核酸病毒。该病毒基因组5′非编码区（untranslated region, UTR）中的内部核糖体进入位点（IRES）元件在病毒复制过程中发挥重要作用。2017年我国出现IRES核心区Domain II 12个碱基非连续插入的自然突变SVA毒株，在病毒复制和致病性方面存在明显改变。【目的】探讨IRES Domain II区域发生的突变对SVA的复制及细胞嗜性的影响，为进一步了解SVA致病机制奠定基础。【方法】以实验室前期构建的含HeN-1/2018株全基因组感染性克隆pHeN-1/2018为基础，通过定点突变的方式，逐步将其IRES Domain II核心区域308—317 nt的9个碱基（ACTCAAGCG）替换为GD04/2017株基因组308—328 nt的21个碱基（CACGCCTGCCGATAGACGATT），构建重组载体pHeN-1/2018-i12并进行了病毒拯救。随后，利用病毒基因组克隆测序、间接免疫荧光试验和Western blot试验对所拯救病毒进行鉴定，同时验证了IRES核心区12个碱基插入突变对SVA病毒体外复制能力和细胞嗜性的影响。【结果】将构建完成的重组载体pHeN-1/2018-i12转染细胞，盲传至P2代，获得致使感染细胞病变明显、病变时间稳定的IRES突变病毒rHeN-1/2018-i12。病毒连续传代后测序结果表明rHeN-1/2018-i12遗传稳定，P5代病毒基因组序列未发生碱基突变，P10代病毒IRES区域没有出现突变现象。用低代次的突变病毒rHeN-1/2018-i12体外感染本体动物猪源细胞系PK-15和IBRS-2，及仓鼠源细胞系BHK-21，进行细胞感染试验，结果表明rHeN-1/2018-i12与亲本毒株rHeN-1/2018在PK-15、IBRS-2和BHK-21中均能导致明显的细胞病变，表现出相似的生长曲线趋势，表明IRES核心区Domain II 12个碱基突变不能够改变对上述细胞的嗜性；但SVA突变病毒和亲本株在不同细胞中的病变时间及病毒滴度上存在较大的差异，rHeN-1/2018-i12株在细胞中生长能力较其亲本株rHeN-1/2018差，诱使细胞病变的时间较晚，在感染24 hpi，两者病毒滴度相差可达10倍。【结论】本研究基于SVA反向遗传操作系统构建并拯救SVA IRES突变毒株，确定了IRES突变对SVA生物学特性的影响，有助于我们更好地了解SVA致病机制，拓宽我们对病毒IV型IRES功能的认识。

关键词：塞内卡病毒内部核糖体进入位点反向遗传操作系统病毒复制细胞嗜性

新型登革病毒RNA聚合酶小分子抑制剂Z1降低登革病毒复制和感染的研究

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中国药理学通报 2018年第6期34卷 790-796页

作者：郭颂欣何士俊黄翠红姚新刚刘叔文南方医科大学药学院广东省新药筛选重点实验室广州市新发病毒防治药物研究重点实验室广东广州510515

目的筛选新型的登革病毒RNA聚合酶抑制剂。方法大肠杆菌原核表达DENV2 RNA聚合酶蛋白NS5RdRp。SPR高通量筛选小分子化合物库,寻找与NS5 RdRp蛋白结合的小分子化合物;CPE、LDH和空斑实验在细胞水平上验证化合物的抗病毒效果;实时荧... 详细信息

目的筛选新型的登革病毒RNA聚合酶抑制剂。方法大肠杆菌原核表达DENV2 RNA聚合酶蛋白NS5RdRp。SPR高通量筛选小分子化合物库,寻找与NS5 RdRp蛋白结合的小分子化合物;CPE、LDH和空斑实验在细胞水平上验证化合物的抗病毒效果;实时荧光定量PCR法检测化合物对病毒RNA合成的影响;免疫荧光法检测病毒复制中间体dsRNA以及病毒蛋白合成;蛋白免疫印迹法检测化合物对病毒蛋白合成量的影响;时间点处理实验判断抗病毒作用阶段。结果 2,5-二氢-1,2-二苯基-4-环己氨基-5-氧代-1H-吡咯-3-甲酸乙酯(Z1)与NS5 RdRp具有结合活性,在细胞水平上具有抗DENV2活性,半数有效浓度(EC50)为4.75μmol·L-1。Z1抑制DENV2 RNA合成,抑制病毒dsRNA的合成,并抑制病毒蛋白的合成,其抑制作用发生在病毒进入后阶段。结论 Z1是新型的登革病毒NS5 RdRp抑制剂,其明显抑制登革病毒RNA的合成,并进一步抑制病毒蛋白的翻译合成,从而抑制子代病毒的复制和释放,其可作为新型的抗登革病毒先导化合物用于进一步的开发。

关键词： NS5 RdRp抑制剂登革病毒RNA聚合酶 2型登革病毒抗病毒药物 SPR 病毒复制

黄曲霉毒素B1对仔猪体内流感病毒复制、器官损伤和肠道菌群的影响

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中国农业科学 2024年第20期57卷 4145-4160页

作者：赵文硕张金龙姚兆然宋宇琪吕顺刘迎雪袁聪聪孙雨航沈阳农业大学动物科学与医学学院

【背景】黄曲霉毒素B1（AFB1）是由寄生曲霉菌产生的次级代谢产物，广泛存在于世界各地受污染的食品和饲料中，被认为是影响人类和动物健康的主要风险因素之一。猪流感病毒（SIV）是目前世界上传播最为广泛的病毒之一，其复制易受环境... 详细信息

【背景】黄曲霉毒素B1（AFB1）是由寄生曲霉菌产生的次级代谢产物，广泛存在于世界各地受污染的食品和饲料中，被认为是影响人类和动物健康的主要风险因素之一。猪流感病毒（SIV）是目前世界上传播最为广泛的病毒之一，其复制易受环境和营养等多种因素影响。然而，饲料中AFB1污染与SIV感染的关系尚不明确。【目的】探究AFB1暴露对SIV感染的仔猪体内SIV复制、器官损伤和肠道菌群的影响，为研究霉菌毒素中毒机制奠定基础，也为探讨其他感染性疾病易感性增加原因提供参考。【方法】选取保育期雄性仔猪32头，随机分为4组（每组8头），在试验开始第1和第4天分别滴鼻接种低致病性SIV病毒稀释液，建立SIV感染仔猪（本体动物）模型。每天新鲜稀释AFB1，按照0、10、20和40μg·kg-1（饲料）浓度灌服给仔猪，持续21 d。分别在第7、14和21天饲喂前对仔猪进行称重，然后应用多种技术手段检测各组仔猪器官脏器指数、剖检变化和病理特征，并在此基础上，进一步使用免疫印迹分析肺部SIV的核衣壳蛋白（NP）的表达情况以及16S rRNA检测肠道菌群变化，阐明AFB1暴露对SIV感染、脏器损伤和肠道菌群的影响。【结果】暴露于40μg·kg-1 AFB1的仔猪较对照组仔猪（无AFB1）体增重显著降低（P复制，加剧了肺组织等器官损伤，并引起肠道菌群紊乱，该发现为研究AFB1的毒性作用机制提供理论参考依据。

关键词：黄曲霉毒素B1 猪流感病毒病毒复制脏器损伤 16S rRNA 肠道菌群

沙库巴曲/缬沙坦通过PI3K/AKT通路抑制CVB3诱导的病毒性心肌炎小鼠中病毒复制及心肌细胞凋亡

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中华微生物学和免疫学杂志 2023年第7期43卷 547-554页

作者：刘文芹许竞刘维克陈奕琏邱依旋林元楠李岳春温州医科大学附属第二医院育英儿童医院数字减影血管造影中心温州325000 金华市中心医院心血管内科二病区金华321000 温州医科大学附属第二医院育英儿童医院心内科温州325000

目的观察沙库巴曲/缬沙坦(LCZ696)对柯萨奇病毒B3(CVB3)诱导的病毒性心肌炎(VMC)小鼠中病毒复制及心肌细胞凋亡的作用,并探究其具体机制。方法40只BALB/c小鼠随机分成4组(n=10):Sham组、Sham+LCZ696组、VMC组和VMC+LCZ696组。向BALB/c... 详细信息

目的观察沙库巴曲/缬沙坦(LCZ696)对柯萨奇病毒B3(CVB3)诱导的病毒性心肌炎(VMC)小鼠中病毒复制及心肌细胞凋亡的作用,并探究其具体机制。方法40只BALB/c小鼠随机分成4组(n=10):Sham组、Sham+LCZ696组、VMC组和VMC+LCZ696组。向BALB/c小鼠腹腔注射10^(6) TCID_(50)/ml浓度CVB30.1 ml建立VMC模型,Sham组注射等量生理盐水,病毒注射当天被定义为第0天。每天60 mg/kg沙库巴曲/缬沙坦进行灌胃治疗,连续7 d。统计小鼠生存率;小动物超声检测小鼠心功能;ELISA法检测肌酸激酶MB同工酶(CK-MB)水平;Western blot检测小鼠心脏促炎因子(IL-6、TNF-α),凋亡相关蛋白(caspase-3、cleaved-caspase-3、Bax、Bcl-2),CVB3病毒表面蛋白(VP-1)及相关通路蛋白(p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT)水平;PCR检测小鼠心脏中CVB3 mRNA水平;HE染色检测小鼠心脏炎性细胞浸润水平;TUNEL检测小鼠心脏组织中细胞凋亡水平。结果与Sham组相比,VMC组生存率下降,心功能指标(LVEDd、LVEDs、LVEF)减退(P复制水平下调(P病毒复制水平以及PI3K/AKT通路相关蛋白均无明显影响。结论沙库巴曲/缬沙坦可通过调控PI3K/AKT通路,显著抑制VMC小鼠的心肌细胞凋亡水平,并降低CVB3在小鼠心脏中的病毒复制水平,抑制心肌炎症,从而改善小鼠心功能及生存率。

关键词：沙库巴曲/缬沙坦病毒性心肌炎 PI3K/AKT通路病毒复制凋亡

MiR-125b-1-3p在轮状病毒复制中的作用研究

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中华微生物学和免疫学杂志 2021年第6期41卷 433-439页

作者：纳璐耿盼盼周艳姚石宝郭梅李鸿钧中国医学科学院北京协和医学院医学生物学研究所分子生物室昆明650031 军事医学研究院辐射医学研究所实验血液学与生物化学研究室北京100850

目的研究miR-125b-1-3p在轮状病毒(rotavirus)复制过程中的作用和调控机制。方法将MA104细胞中的miR-125b-1-3p分别上调和下调后感染轮状病毒,通过RT-PCR分析miR-125b-1-3p的表达情况和轮状病毒拷贝数;免疫荧光分析miR-125b-1-3p对轮状... 详细信息

目的研究miR-125b-1-3p在轮状病毒(rotavirus)复制过程中的作用和调控机制。方法将MA104细胞中的miR-125b-1-3p分别上调和下调后感染轮状病毒,通过RT-PCR分析miR-125b-1-3p的表达情况和轮状病毒拷贝数;免疫荧光分析miR-125b-1-3p对轮状病毒蛋白表达情况的影响;Western blot分析miR-125b-1-3p参与调控的相关蛋白表达情况。结果轮状病毒感染细胞后,miR-125b-1-3p的表达水平明显上调,上调miR-125b-1-3p后,轮状病毒的VP7、NSP3基因拷贝数下降,下调miR-125b-1-3p后,轮状病毒的VP7、NSP3基因拷贝数明显升高;上调miR-125b-1-3p的表达水平后轮状病毒蛋白荧光数下降,下调miR-125b-1-3p后,病毒蛋白荧光数增加;轮状病毒感染细胞16 h后PI3K/Akt通路活性受到抑制,上调miR-125b-1-3p能够抑制PI3K/Akt通路的活化。结论miR-125b-1-3p通过调控PI3K/Akt通路抑制轮状病毒的复制。研究结果为探讨miR-125b-1-3p和PI3K/Akt通路之间的具体调控机制研究提供了实验基础,为轮状病毒抗感染治疗提供了靶点。

关键词：轮状病毒 miRNA PI3K/Akt 病毒复制抗病毒反应

HBV核心启动子突变与临床表现及病毒复制的关系

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中华实验和临床病毒学杂志 2005年第1期19卷 25-27页

作者：戴二黑刘恒军宋亚军陈翠英杨瑞馥石家庄市第五医院中心实验室 050021 军事医学科学院微生物流行病研究所

目的　探讨HBV核心启动子nt176 2～ 176 4突变与肝病严重性的关系以及对e系统状态和病毒复制的影响。方法　采用半套式突变特异PCR (msPCR)技术检测 97例各型肝病患者血清nt 176 2～ 176 4突变株的感染状况。结果　经测序和扩增产物电... 详细信息

目的　探讨HBV核心启动子nt176 2～ 176 4突变与肝病严重性的关系以及对e系统状态和病毒复制的影响。方法　采用半套式突变特异PCR (msPCR)技术检测 97例各型肝病患者血清nt 176 2～ 176 4突变株的感染状况。结果　经测序和扩增产物电泳证实 ,采用我们设计的引物建立的msPCR方法检测HBV感染者血清nt 176 2～ 176 4突变株和野生株的特异性强 ,方法可靠。急性肝炎、慢性肝炎轻度、中度、重度及肝硬化患者nt176 2～ 176 4突变株感染比例分别为 2 5、7 4 3、10 31、1 3和7 15 ,肝硬化患者nt 176 2～ 176 4突变株感染率显著高于慢性肝炎轻度患者 (P 病毒复制无任何关?

关键词：突变株病毒复制核心启动子 HBV 血清轻度 e系统扩增产物混合感染引物

DEAD-box解旋酶21对猪传染性胃肠炎病毒复制的调控作用

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华北农学报 2024年第4期39卷 215-222页

作者：谢立兰尹杰黄冬蛾李么明湖北理工学院医学院湖北黄石435003 湖北省病毒载体工程技术研究中心湖北武汉430415 武汉生物工程学院应用生物技术研究中心湖北武汉430415

旨在探究DEAD-box解旋酶21(DDX21)对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)复制的调控作用。首先通过蛋白免疫印迹(Western Blot)分析了TGEV感染对DDX21表达的影响;进一步构建了猪DDX21真核表达质粒以及建立稳定敲低DDX21的PK-15细胞系,运用荧光定量... 详细信息

旨在探究DEAD-box解旋酶21(DDX21)对猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)复制的调控作用。首先通过蛋白免疫印迹(Western Blot)分析了TGEV感染对DDX21表达的影响;进一步构建了猪DDX21真核表达质粒以及建立稳定敲低DDX21的PK-15细胞系,运用荧光定量PCR(RT-qPCR)、蛋白免疫印迹、间接免疫荧光(IFA)和半数细胞培养物感染量(TCID 50)探究外源过表达DDX21及敲低DDX21对TGEV体外复制的调控作用;构建一系列DDX21截短突变体真核表达质粒,鉴定了DDX21调控TGEV增殖的关键功能域。Western Blot分析显示,在TGEV WH-1株感染早期,PK-15细胞内源性DDX21蛋白的表达水平显著上调;RT-qPCR、Western Blot、IFA和TCID 50试验显示,超表达DDX21可以显著提高TGEV N基因的mRNA水平、N蛋白的表达及病毒滴度,且呈剂量依赖性,其601-784 aa区域是其影响TGEV复制的关键;与阴性对照相比,在相应DDX21敲低细胞系中TGEV的增殖显著被抑制,而回补试验逆转了DDX21敲低细胞系中TGEV的滴度。该研究首次揭示了猪DDX21对TGEV增殖的促进作用并鉴定了其调控TGEV复制的关键结构域,为今后研究DDX21蛋白的功能及TGEV的致病机理提供了理论依据。

关键词：猪传染性胃肠炎病毒 DEAD-box解旋酶21 宿主蛋白病毒复制