冠突散囊菌野生型与△veA基因缺失突变菌株的蛋白差异比较研究

作     者：桑石磊 

作者单位：贵州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘作易

授予年度：2015年

学科分类：0710[理学-生物学] 071010[理学-生物化学与分子生物学] 07[理学] 

主      题：veA基因 冠突散囊菌 产孢 蛋白质组学 双向电泳 

摘      要：在真菌中,veA基因在调节有性发育、无性发育和次级代谢中发挥重要作用。veA基因作为重要的调节子,在众多真菌中保守,特别是在子囊菌中。冠突散囊菌(Eurotium cristatum)是茯砖茶发花过程中的优势菌,既能产有性孢子又能产无性孢子,是研究产孢机理的良好材料。在低渗透压条件下,冠突散囊菌野生型菌株只产生子囊孢子,△veA缺失突变体只产生分生孢子。veA基因既能够正向调控有性产孢也能够反向调控无性产孢。目前对于冠突散囊菌的产孢机理的研究仍然处于初级阶段。蛋白质是生命活动的执行者,从蛋白质组学方面研究冠突散囊菌的产孢机理具有非常重要的意义。本研究以冠突散囊菌野生型菌株和△veA缺失型菌株为研究材料,每个样品重复三次。用长度24cm的IPG胶条(pH4-7)等电聚焦,用十二烷基硫酸钠凝胶电泳分离差异蛋白。银染用于差异斑点分析,考马斯亮蓝R-250染色用于质谱鉴定,用ImageMaster 2D platinum软件分析差异蛋白点,选取差异倍数大于2倍,P0.05的差异表达蛋白点。然后,将所选取的差异蛋白用MALDI-TOFMS质谱分析,在NCBI数据库中搜索,鉴定出差异蛋白。最后对差异蛋白运用生物信息学进行GO和KEGG分析。结果如下:1)冠突散囊菌野生型、△veA缺失突变体样品的蛋白质浓度依次为:3.208μg/μL、3.411μg/μL。双向电泳分离的差异蛋白点:野生型样本获得了约1378±53个蛋白点,△veA缺失突变体样本获得了约1732±94个蛋白点。2)以差异表达上下调2倍为标准,共筛选出193个差异表达的蛋白点,其中在野生型中表达上调的差异蛋白点有77个,在缺失型中表达上调的差异蛋白点有116个。对差异蛋白点进行质谱技术鉴定,结果表明:76个蛋白被成功鉴定,△veA缺失突变体对应于野生型菌株上调表达的蛋白有53个,下调表达23个。IV3)GO注释表明:差异蛋白主要的功能是离子结合和氧化还原;主要参与的生物过程有小分子代谢过程和生物合成过程;主要的细胞组分是属于细胞质和细胞内。KEGG pathway分析表明:产孢相关的差异蛋白涉及9种重要的代谢通路,结果发现这些蛋白与糖类代谢、氨基酸生物合成代谢、及生物氧化等途径相关,另外还有一些未知蛋白。4)微管蛋白、蛋白磷酸酶(PP2A)、真核细胞翻译起始因子(eIF)等都在△veA缺失突变体中表达上调,这些蛋白在产孢过程中都发挥重要作用,可能与某些代谢通路相关。这些差异蛋白在冠突散囊菌产孢和发育过程中的功能和调控机制还需要进一步的验证。