菊花生长素响应因子CmARF2,3,4,的克隆及CmARF3功能鉴定

作     者：时春美 

作者单位：南京农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：陈素梅

授予年度：2017年

学科分类：090706[农学-园林植物与观赏园艺] 0907[农学-林学] 09[农学] 

主      题：菊花 生长素响应因子 转录因子 基因克隆 

摘      要：菊花(Chrysanthemum morifolium)为菊科菊属多年生宿根草本植物,原产我国,在我国有着悠久的栽培历史,是我国十大传统名花和世界四大切花之一,在世界鲜切花消费中仅次于月季,具有较高的观赏和经济价值,在现代花卉产业中占据着重要的地位。菊花花型丰富,植株形态多样,然而菊花生长发育的分子调控机制仍然知之甚少。生长素是最重要的植物激素之一,与植物根系发生、伸长生长、细胞的生长、分裂、分化、开花、营养吸收等生命活动密切相关。植物生长素信号转导与作用机制研究一直是国内外研究的热点,其中,生长素响应因子ARF在生长素信号转导过程起着十分关键的作用。为此,本研究从菊花中分离克隆出菊花CmARF2,3,4基因,对其表达特性、亚细胞定位及转录激活活性等进行了研究,获得CmARF3基因超表达转基因菊花株系,探讨了 CmARF3在菊花生长发育过程中的作用。主要研究结果如下:1.同源克隆了菊花CmARF基因的cDNA全长序列,分别命名为CmARF-2、CmARF3和CmARF4。序列分析显示,CmARF2基因全长2842bp,开放阅读框(ORF)为2364bp,编码787个氨基酸,推导的氨基酸序列与芝麻同源性最高,为62.19%;CmARF3基因全长2115bp,开放阅读框(ORF)为1866bp,编码621个氨基酸,推导的氨基酸序列与可可树同源性最高,为39.64%;CmARF4基因全长3109bp,开放阅读框(ORF)2322bp,编码773个氨基酸,推导的氨基酸序列与葡萄同源性最高,为 50.24%。2.荧光定量PCR结果表明,CmAARF2、CmARF3和CmARF4基因在切花菊‘神马’的根、茎、叶都有表达,CmARF2的表达水平由高到低依次是叶、根、茎。CmARF3的表达水平由高到低依次是茎、叶、根。CmARF4的表达水平由高到低依次是茎、叶、根。3.构建绿色荧光蛋白融合表达载体pMDC43-GFP-CmARF2、pMDC43-GFP-CmARF3和pMDC43-GFP-CmARF4,基因枪法转化洋葱表皮细胞进行瞬时表达,结果表明,菊花CmARF2、CmARF3和CmARF4蛋白定位在细胞核。4.构建 了 酵母表达载体 pGBKT7-CmARF2、pGBKT7-CmARF3 和pGBKT7-CmARF4。转入酵母菌株Y2H中,分别在单缺陷培养基SD/-Trp、双缺培养基SD/-His-Ade上筛选培养。结果表明,CmARF2、CmARF3和CmARF4都不具有转录激活活性。5.构建了植物超表达载体pMDC32-CmARF3,利用农杆菌介导的叶盘侵染法转化菊花,通过潮霉素抗性筛选、PCR检测及表达量鉴定,获得了 2个OX-CmARF3超表达株系。对获得的超表达株系的研究表明,CmARF3对CmIPT5和CmWUS有转录抑制作用,CmARF3基因主要调控不定芽再生、叶片与茎的夹角,叶型变长及株高增加,不调控根系的发育。