热休克蛋白A12B对心脏缺血/再灌注损伤保护作用的初步研究

作     者：戴乐杨 

作者单位：南京医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：丁正年

授予年度：2017年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：热休克蛋白A12B 心肌缺血再灌注损伤 心肌细胞凋亡 

摘      要：背景和目的:冠心病是世界范围内的主要死亡原因之一,其发病率与死亡率逐年增加且近年呈年轻化的趋势。目前,再灌注疗法已经成为治疗冠心病的重要手段,重新恢复缺血心肌的血流能够有效缩小梗死面积,改善长期预后,降低死亡率。然而,在血流恢复的早期,可能进一步加重原有的心肌缺血性损伤,包括梗死面积扩大、心律失常、猝死等,这种现象被称为心肌缺血/再灌注(Ischemia/reperfusion,I/R)损伤。因此只有减轻I/R损伤,才能有效保证血流再灌注的治疗效果。I/R损伤的病理机制尚未完全阐明,但资料显示可能与内皮细胞的功能障碍、氧化应激、细胞内钙超载等有关。此外,I/R能够通过上调促凋亡蛋白水平,下调抗凋亡蛋白水平,或者通过激活细胞的死亡信号受体而引起心肌细胞凋亡,导致心肌细胞数量减少,心功能障碍。因此心肌细胞凋亡是I/R损伤重要的病理机制之一,减少细胞凋亡即有保护受损心肌的作用。近年来研究发现,在动脉粥样斑块中克隆到的热休克蛋白A12B(Heat shock protein A12B,HSPA12B)可以通过保持血脑屏障的完整性,减少细胞凋亡,减轻大脑I/R损伤;通过调节血管再生,增加毛细血管和小动脉的密度,改善心肌梗死(Myocardial infarction,MI)后心室重塑。HSPA12B在心肌I/R损伤中的生物学作用尚未明确。本实验采用课题组前期构建的高表达HSPA12B转基因小鼠,探索HSPA12B在心肌I/R损伤中的作用及可能机制。方法:1.构建实验动物模型:本课题组与南京大学模式动物研究所合作,通过哺乳动物基因转移方法,将含有人hspa12b基因的基因表达片段通过显微注射注入C57BL/6小鼠受精卵原核中,得到携带有人hspa12b基因的转基因动物。通过蛋白质免疫印迹法测定野生型(Wild type,WT)和转基因小鼠(Transgenic mice,Tg)心肌组织中HSPA12B蛋白表达水平以确定模型构建成功。通过免疫荧光确定HSPA12B特异性表达于内皮细胞。2.构建心肌I/R模型:吸入1.5-2%异氟烷麻醉小鼠在达到麻醉状态后,开胸暴露心脏,结扎冠脉左前降支引起心肌缺血,于45 min后解除结扎进行血流再灌注。假手术(Sham)组除不结扎血管外,其他步骤均与I/R手术一致。3.检测心肌HSPA12B的表达:通过实时定量PCR检测小鼠心肌组织中HSPA12B mRNA的表达量。4.评价心功能:利用超声心动图检测小鼠心功能。5.检测梗死面积:采用TTC染色法测定I/R小鼠的心肌梗死面积。6.评价心肌细胞凋亡状况:制作小鼠心脏石蜡切片并进行TUNEL法染色,观察TUNEL阳性的细胞个数,通过蛋白质免疫印迹法测定凋亡相关蛋白的表达水平:Bcl-2,Bax。7.探索信号通路:通过蛋白免疫印记技术检测心肌组织中目标蛋白表达水平:PI3K/Akt/mTOR信号通路。通过注射小鼠PI3K的拮抗剂预处理,观察阻断该信号通路对HSPA12B改善I/R心功能不全的影响。8.统计学分析:本课题组运用GraphPad Prism6处理实验数据。所有数据均以均数±标准差(χ±SD)表示,两组数据之间采用均数检验(t检验),多组实验数据之间采用方差分析(ANOVA)进行比较及Tukey事后比较法进行两两比较,P0.05提示有显著性差异。实验结果:1.I/R损伤使心肌组织HSPA12B的表达水平升高。2.高表达HSPA12B改善I/R后小鼠心脏的收缩功能。3.高表达HSPA12B缩小心肌梗死面积。4.高表达HSPA12B减少I/R后心肌细胞凋亡。5.高表达HSPA12B激活PI3K/Akt/mTOR信号通路。6.阻断PI3K/Akt/mTOR信号通路后,HSPA12B对I/R小鼠心功能的保护作用消失。结论:I/R上调心肌组织HSPA12B表达,而高表达HSPA12B显著改善I/R小鼠心功能,缩小梗死面积,减少心肌细胞凋亡。HSPA12B对心肌I/R损伤的这些保护作用依赖于对PI3K/Akt/mTOR信号通路的激活。结果提示,HSPA12B可能是心肌I/R损伤新的干预靶点。