TMEM100在非小细胞肺癌中的作用及机制研究

作     者：何纤 

作者单位：重庆医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：何於娟

授予年度：2019年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：非小细胞肺癌 TMEM100 自噬 内质网应激 

摘      要：目的肺癌是中国乃至全世界发病率和死亡率最高的恶性肿瘤之一,每年约有160万人死于肺癌,其中非小细胞肺癌(NSCLC)占80%以上,随着吸烟和环境污染的加剧,肺癌的发生率也在逐年增高。NSCLC是一种复杂的异质性病变,部分患者表现为KRAS突变,TP53突变,LKB1突变,EGFR突变或ALK重组等分子改变。因此,尽管分子靶向药物已应用于临床治疗并取得了一定的成效,但由于肺癌的晚期诊断及早期转移,分子靶向药物的非广谱性及广泛存在的个体差异,使得肺癌患者的五年生存率仍低于15%。因此,深入研究NSCLC发生发展的分子机制和寻找相关的新型分子靶标对于NSCLC的早期诊断和治疗尤为重要。方法1.下载GEO数据库中NSCLC表达谱芯片数据,筛选出肿瘤组织和对照组织的差异基因,对差异基因进行GO、KEGG和蛋白-蛋白相互作用(PPI)分析,确定候选基因,并在TCGA、CCLE中对候选差异基因进行表达验证,同时在Kaplan-Meier Plotter中分析候选差异基因对NSCLC患者生存的影响。2.分别在NSCLC组织和细胞系中通过免疫组化和Q-PCR验证候选差异基因的表达。在NSCLC细胞中过表达和干扰候选基因后通过CCK8、集落形成实验、细胞周期分析探索候选基因对NSCLC细胞增殖、周期的影响,采用流式细胞术和蛋白质印迹(Western Blot,WB)技术检测候选基因对细胞凋亡的作用,通过划痕实验和Transwell实验明确候选基因对细胞迁移的效应。3.在NSCLC细胞中过表达和干扰候选基因后检测其对细胞自噬的影响,并探索自噬与凋亡的关系。4.对过表达候选基因的A549细胞和对照细胞进行全转录组测序分析,为后续机制研究提供线索。5.构建候选基因稳定表达细胞株进行动物实验。结果1.以P值小于0.01,logFC绝对值大于等于1.5为标准,从4个人NSCLC相关的GEO数据集(GSE19804、GSE27262、GSE43458、GSE18842)中筛选出23个共同上调基因和121个共同下调基因。其中TMEM100是下调最显著的基因之一,其在4个数据集中的logFC绝对值均大于3。GO分析显示TMEM100主要涉及内皮细胞分化和发育、血管形成、蛋白激酶B(PKB)信号通路、间质细胞分化、上皮间质转变(EMT)、BMP信号通路等,这些生物过程均与肿瘤的发生发展密切相关。同时TMEM100在NSCLC中的低表达在TCGA、CCLE数据库中也得到了验证,且TMEM100的表达还和患者的分期呈负相关,和生存率呈正相关,表明TMEM100可能是潜在的抑癌基因,在NSCLC中发挥作用。2.在人NSCLC组织样本和细胞系中同样发现TMEM100呈低表达状态。过表达TMEM100显著抑制A549细胞增殖、集落形成,引起细胞周期阻滞,促进细胞凋亡。在H460细胞中干扰TMEM100后得到相反的结果。用稳定过表达TMEM100的A549和对照细胞进行裸鼠成瘤实验,发现TMEM100能抑制裸鼠皮下瘤生长。3.过表达TMEM100后A549细胞中LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的比值增加,p62水平降低,且TMEM100能显著抑制PI3K和AKT的磷酸化水平,在H460中干扰TMEM100后得到相反的结果。用巴弗洛霉素(Baf-A1)抑制自噬后能促进TMEM100诱导的A549细胞凋亡。4.全转录组测序结果显示过表达TMEM100后有1767个基因上调,1092个基因下调(P0.05,|logFC|≥1为阈值),GO分析发现这些差异基因富集的生物学过程很多与内质网应激和内质网未折叠蛋白应答相关,KEGG通路分析也显示富集的信号通路中最具显著性的为内质网蛋白加工,对内质网应激相关基因的差异表达分析发现CHOP,GADD34,PERK等显著降低。定位分析也显示TMEM10主要位于内质网和细胞膜。过表达TMEM100能抑制A549内质网应激相关蛋白如CHOP、XBP1的表达,在H460中干扰TMEM100得到相反的结果。提示TMEM100可能通过抑制内质网应激发挥作用,但机制有待进一步研究。结论本研究筛选出TMEM100作为潜在的抑癌基因,证实其能通过激活自噬和抑制内质网应激反应抑制NSCLC的发生发展。