YAP的表达水平对氯胺酮诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的调控

作     者：陈艳妮 

作者单位：安徽医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李元海;李俊

授予年度：2019年

学科分类：1002[医学-临床医学] 10[医学] 100217[医学-麻醉学] 

主      题：YAP 氯胺酮 SH-SY5Y 神经毒性 凋亡 

摘      要：目的探讨不同浓度的氯胺酮对人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)的活性和增殖能力的影响,明确氯胺酮的神经毒性;并探索Yes相关蛋白(Yes-associated protein,YAP)的表达量不同时对氯胺酮介导的神经毒性的调控,探索YAP在促进细胞增殖方面的作用。方法实验用SH-SY5Y细胞获赠于上海中医药大学神经退行性疾病研究组,柯尊记实验课题组,根据标准培养方法用DMEM基础培养基(Dulbeccos Modified Eagle Medium)进行培养,在后续实验中每两天更换一次新鲜培养液。为保证不同处理条件下的细胞状态大致相同,所有实验均选用复苏后第2-4次传代的细胞。1.按标准培养SH-SY5Y细胞,传代24小时后细胞贴壁时给予氯胺酮处理,使之形成不同的终浓度。实验细胞分为6组,分别为:HO诱导细胞凋亡的阳性对照组(P组),即向细胞液中加入HO试剂,使细胞所处培养液的终浓度为400?M;空白对照组(B组);根据给予氯胺酮浓度的不同,将实验组分为四个浓度梯度:氯胺酮终浓度分别为400?M组(S组),800?M组(S组),1200?M组(S组),1600?M组(S组)。处理12h和24h后用CCK-8法检测,并计数细胞数量,以观察氯胺酮对SH-SY5Y细胞活性和增殖能力的影响。2.用Annexin V-APC/7-AAD流式细胞术检测不同处理条件下的氯胺酮对SH-SY5Y细胞凋亡率的影响。免疫荧光和Western blotting检测凋亡相关蛋白的表达水平,探讨氯胺酮诱导SH-SY5Y细胞凋亡的机制。3.由于YAP作为Hippo信号通路的下游效应分子,具有维持干细胞的自我更新和分化,调节器官大小和肿瘤形成的作用。本实验采用shRNA重组慢病毒法增加YAP的表达量,使用Lipofectamine 2000脂质转染siRNA使SH-SY5Y细胞中的YAP表达水平减低,再用不同浓度的氯胺酮进行处理,并设置对照组。然后用流式细胞术,免疫荧光染色和Western blotting检测上述细胞凋亡蛋白的表达水平,推测YAP表达水平不同对氯胺酮所致的SH-SY5Y细胞凋亡的影响。结果1.与B组相比,S,S,S,S组在不同的处理时间下(12h,24h)均会使SH-SY5Y细胞的活力和增殖力下降(P0.05)。氯胺酮的处理浓度有差别时,对SH-SY5Y细胞活性和增殖能力的作用也有所区别,随着氯胺酮浓度的增加,SH-SY5Y细胞数量减少幅度增大,细胞活性和增殖能力降低,各组之间的比较具有统计学差异(P0.05)。24h的处理比12h时的影响更明显,氯胺酮降低SH-SY5Y细胞的活性和增殖能力呈剂量依赖性。2.分别与P组,B组进行比较,氯胺酮能使SH-SY5Y细胞发生细胞凋亡,且呈剂量依赖性。氯胺酮终浓度为400,800,1600?M,各组之间的比较有统计学差异(P0.05)。实验组与对照组对比,差异有统计学意义(P0.05)。3.与对照组相比,SH-SY5Y细胞在YAP过表达后再用氯胺酮处理,细胞的活性和增殖能力高于对照组,细胞增殖数量高于对照组,细胞凋亡率下降,Cleaved Caspase-3和Bax的表达量下降,Bcl-2的表达量升高,结果有统计学意义(P0.05)。YAP水平升高对细胞活性和增殖能力有积极影响:YAP过表达可促进细胞增殖,降低氯胺酮诱导的SH-SY5Y细胞凋亡。YAP敲减后再给予相同浓度的氯胺酮处理,与YAP正常表达的对照组相比,凋亡率增加,凋亡蛋白的表达水平也产生相应的变化。以上结果有统计学差异(P0.05),YAP表达量减少会加重氯胺酮诱导的细胞凋亡。结论氯胺酮能够降低SH-SY5Y细胞的活性和增殖能力,引起细胞凋亡,且呈剂量依赖性。YAP过表达可以减轻氯胺酮产生的SH-SY5Y细胞毒性,降低细胞凋亡率,能够减弱氯胺酮诱导的SH-SY5Y细胞凋亡作用;YAP表达水平减低会加重氯胺酮产生的SH-SY5Y细胞凋亡,加重氯胺酮诱导的SH-SY5Y细胞凋亡。由以上结果可以看出,YAP表达水平对氯胺酮诱导的SH-SY5Y细胞凋亡具有一定的调节作用。