MDM4在甲基苯丙胺激活小胶质细胞中的作用及木犀草素缓解甲基苯丙胺肝毒性机制初探

作     者：曲东 

作者单位：南方医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王慧君

授予年度：2019年

学科分类：100405[医学-卫生毒理学] 1004[医学-公共卫生与预防医学(可授医学、理学学位)] 10[医学] 

主      题：甲基苯丙胺(METH) 小胶质细胞 MDM4 肝毒性 木犀草素(Luteolin) 转录组测序 

摘      要：第一部分MDM4在参与甲基苯丙胺激活小胶质细胞中的作用机制研究研究背景:甲基苯丙胺(Methamphetamine,METH)是一种神经兴奋性人工合成毒品,属于苯丙胺类兴奋剂之一,其分子结构类似于神经递质儿茶酚胺,易溶于水、酒精等溶剂,因外观类似冰晶,故又称“冰毒,在世界各国广泛滥用,其危害公共卫生及社会安全的趋势愈发严重,是目前全球范围内对公共卫生及社会安全危害最严重的毒品之一。METH最开始是作为一种控制食欲的药物在使用,后衍变为精神类毒品,其可以给吸食者带来短暂的身心愉悦的状态,与此同时也带来危害严重的副作用。吸食甲基苯丙胺后主要对中枢神经系统、心血管系统及肝、肾等脏器造成损伤。目前已有文献表明:甲基苯丙胺毒性作用的靶器官是人体的中枢神经系统,可以导致中枢神经系统中神经元的凋亡自噬、星形胶质细胞的炎症反应和自噬及可引起小胶质细胞的激活等反应,上述中枢神经系统中的细胞的功能紊乱也可以导致如亨廷顿、帕金森等神经性退行性变症状的出现,最终影响神经系统的正常功能。本课题组一直致力于甲基苯丙胺神经毒性研究,本课题组已经发现甲基苯丙胺能够引起神经元凋亡及星胶的炎症反应。除此之外,亦有大量临床及死后病理解剖数据显示,长期吸食冰毒者的脑部除存在神经元凋亡、星形胶质细胞激活,还伴随着神经炎症反应的存在。神经炎症反应在中枢神经系统中扮演着十分重要的角色。神经系统炎症反应同中枢神经系统中间质细胞(如星形胶质细胞、小胶质细胞)有着密切的关系,尤其是小胶质细胞,其约占脑中细胞数量的10-20%之间,数量同神经元数量相当,位于大脑应对外来有害刺激的最前线。小胶质细胞作为中枢神经系统内一种特化的免疫细胞,它的存在在维持脑正常功能发挥着重要的作用,可以不断清除中枢神经系统中其他细胞凋亡产生的凋亡小体、外来物质、局部感染等,在维持中枢神经系统稳态方面发挥着十分重要的作用,尤其是在帕金森、多发性硬化及阿尔茨海默症等中枢神经系统疾病的发展过程中。前期本课题组主要研究内容是METH所致神经元凋亡、自噬及METH诱导的星形胶质细胞自噬、炎症通路机制的研究等,在此基础上,开展了微小RNA(micro RNA,miRNA)对METH所诱导的星形胶质细胞自噬、炎症调控作用的研究。在METH导致的星形胶质细胞自噬、炎症细胞模型中,通过miRNA芯片检测筛选到差异性表达的miRNA,其中miR-10lb-3p上调明显。根据miR-10lb-3p的RNA序列,利用生物信息学技术筛选到MDM4是miR-10lb-3p调控的可能靶点。但在随后的实验中发现,miR-l0lb-3p对MDM4的调控作用甚微,MDM4对自噬及炎症的调控存在一定作用但效果并不稳定且不显著,故研究重心从miR-10lb-3p对星形胶质细胞自噬、炎症的调控机制研究转移到MDM4对星形胶质细胞自噬、炎症的调控机制研究。但MDM4在星形胶质细胞中对自噬及炎症的调控存在一定作用但效果并不稳定且不显著,推测可能是由于星形胶质细胞并非中枢神经系统的专职炎症细胞而导致的。意外的是,虽然MDM4在METH导致的星形胶质细胞中的调控作用不明显,但在研究中发现在小胶质细胞内,METH可诱导MDM4表达上调并促进小胶质细胞的自噬及炎症的发生,且MDM4对自噬及炎症的调控效果显著。这一结果,促使了我们对MDM4的上调与自噬的发生及炎症的激活三者之间的关系产生强烈的探讨兴趣,拟通过本研究对METH处理的小胶质细胞中MDM4、自噬及炎症的相互调控关系的研究,探讨甲基苯丙胺在激活小胶质细胞中的可能作用机制。目的:本研究拟通过建立METH神经毒性体外模型,利用免疫学及分子生物学等技术,探讨在METH诱导的小胶质细胞激活中MDM4的作用机制,并通过分子生物学手段调控MDM4的表达,检测MDM4对小胶质细胞激活的调控作用及可能涉及到的分子通路,从而研究METH诱导小胶质细胞活化的可能分子机制,为进一步明确MDM4在METH激活小胶质细胞活性中的调控机制奠定基础方法:***诱导小胶质细胞自噬及MDM4升高模型建立(l)接种BV2细胞细胞至6孔板中,5%C02和37℃条件下培养细胞,待长至60-80%汇合程度时,分别用溶于2%FBS的DMEM高糖培养基的METH浓度为0mmol/L、0.4mmol/L、0.8mmol/L、lmmol/L、2mmol/L、3mmol/L处理24小时。提取总蛋白,Western Blot检测MDM4的表达水平及自噬相关分子的表达水平,根据METH浓度梯度处理后MDM4的变化趋势确定合适的METH给药浓度。(2)根据上述实验的结果中MDM4及自噬的变化趋势,选择最适合的METH处理浓度,并以该浓度处理0h、6h、12h、24h、36h及48h,以此建立时间梯度处理实验,处理相应时间后,提取总蛋白,Wester