隐丹参酮与丹参酚酸类化合物的心肌保护作用及对eNOS/GRK2的调节作用

作     者：许佳慧 

作者单位：郑州大学 

学位级别：硕士

导师姓名：王振基;毕跃峰

授予年度：2019年

学科分类：1006[医学-中西医结合] 10[医学] 100602[医学-中西医结合临床] 

主      题：心肌缺血再灌注 隐丹参酮 丹参酚酸 eNOS GRK2 

摘      要：心肌缺血再灌注损伤会加速心肌死亡,严重威胁人类健康。丹参是心血管疾病常用中药,其活性成分主要分为脂溶性丹参酮类(隐丹参酮(Cryptotanshinone,CT)和水溶性的丹参酚酸类(丹参素(Danshensu,DSS)和原儿茶酸(Protocatechuic acid,PCA),对心血管系统均有一定的保护作用,但两者作用机制、途经有所不同。本课题组通过建立心肌缺血再灌注模型及Western Blot研究隐丹参酮和丹参酚酸类化合物(Salvianolic acids,SAs)联用的心肌保护作用,探讨化合物联用对eNOS/GRK2的调节作用。方法:体外建立大鼠心肌细胞缺氧-复氧(Hypoxia-reoxygenation,HR)模型。以单硝酸异山梨酯(10μM)为阳性对照药,检测CT(1、3和10μM)、DSS和PCA(3、10和30μM)、CT与DSS、CT与PCA联用的细胞保护作用。并测定培养液中的LDH、MDA和SOD的含量。体内建立大鼠心肌缺血再灌注损伤(Ischemia-reperfusion injury,IRI)模型。将大鼠随机分为:正常组、假手术组、模型组、阳性(单硝酸异山梨酯)组、CT组(10、20和40 mg/kg)、DSS组(30、60和120 mg/kg)、PCA组(30、60和120 mg/kg)、CT和DSS联用组、CT和PCA联用组。检测各组的心肌梗死率、血浆CK-MB、LDH、MDA和SOD含量。利用Western Blot检测体内、体外各组的eNOS和GRK2蛋白表达水平的变化。结果:体外,HR会使心肌细胞活力下降(0.627±0.021)。高浓度CT、PCA和DSS能显著增加因HR损伤降低的细胞活力(0.778±0.035、0.713±0.036和0.886±0.046),CT与PCA和DSS联用后细胞活力显著高于单用(0.866±0.027和0.902±0.023)。LDH、MDA和SOD与细胞活力值相符。体内,IR可以增加心肌梗死率(54.0%±3.4%)。CT的低浓度组可以更好的减少心肌梗死率(20.0%±2.1%)。PCA的低浓度组效果更好(17.4%±3.3%),但低、中和高浓度组间没有显著性差异。DSS高剂量组表现出较好的心肌保护作用(19.2%±5.7%)。而CT与PCA和DSS联用后在所测浓度下,都有较好的心肌保护能力,与单用时有显著性差异(11.5%±1.4%和14.4%±3.5%)。CK-MB、LDH、MDA和SOD值与心肌梗死率相符。体内、外的Western Blot实验表明,相比于模型组,CT能通过增加心肌细胞中eNOS的磷酸化水平,增加p-eNOS/GRK2的水平,起到保护心肌的作用。相比于CT,PCA、DSS能显著降低GRK2蛋白表达水平,但对于eNOS的表达影响较小,也提高p-eNOS/GRK2的相对水平。相比于单用,CT与PCA及DSS联用后可以显著增加eNOS磷酸化水平并降低GRK2表达水平,p-eNOS/GRK2相对水平增加显著。与组织中p-eNOS/GRK2水平变化相一致。结论:CT与PCA和DSS联用可以显著增加p-eNOS/GRK2水平,保护心肌。表明其心肌保护作用机制与调节eNOS/GRK2平衡相关。本论文探讨了CT与PCA和DSS对eNOS/GRK2的调节机制,初步阐明了化合物的作用机制。为深入研究其心血管保护机制奠定基础,为丹参的进一步开发与临床应用提供科学依据,为中药多组分、多靶点在心肌保护作用及其机制研究方面提供思路。