PTEN-Long对胶质瘤细胞生物学活性的影响

作     者：耿连婷 

作者单位：河北大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李春晖

授予年度：2019年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：PTEN-Long U251 胶质瘤 增殖 迁移 侵袭 PI3K-AKT-NF-kB 裸鼠 

摘      要：目的:PTEN-Long是第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源基因(phosohatase and tensin homolgue deleted on chromosome 10,PTEN)的翻译变体,探索PTEN-Long对胶质瘤细胞U251增殖、迁移、侵袭的影响及相关分子机制,并分析PTEN-Long在体内水平对胶质细胞瘤的影响。方法:1.将携带PTEN-Long基因的重组慢病毒载体转染人胶质瘤细胞U251,未感染慢病毒的细胞为对照组(U251);感染LV-EGFP的细胞为空载组(U251-EGFP);感染LV-PTEN-Long-EGFP的细胞为过表达组(U251-PTEN-Long-EGFP)。通过荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达情况,并应用RT-PCR、Western blot法检测转染效率。2.应用CCK8法检测PTEN-Long过表达后对各组细胞增殖能力的影响。通过流式细胞分析术检测各组的细胞周期差异。3.通过划痕实验检测PTEN-Long过表达后对各组细胞迁移能力的影响,并通过Transwell小室法检测各组细胞的侵袭能力。4.通过RT-PCR、Western blot法检测PTEN-Long过表达后对PI3K-AKT-NF-kB信号通路中相关分子表达水平的影响。5.在裸鼠皮下注射各组细胞种植异体移植胶质瘤,观察裸鼠一般状况及皮下肿瘤生长趋势。记录并分析各组裸鼠皮下肿瘤的体积及重量,通过免疫组织化学染色法检测各组皮下肿瘤中PTEN-Long、p-Akt、NF-κB p65蛋白表达情况。结果:***-PTEN-Long-EGFP转染人胶质瘤细胞U251后,经荧光显微镜、RT-PCR(F=65.42,P﹤0.01)和Western blot法(F=103.23,P﹤0.01)证实转染效率符合要求,PTNE-Long在细胞中稳定表达。***-Long过表达组(U251-PTEN-Long-EGFP)与对照组(U251)及空载组(U251-EGFP)相比较,其细胞增殖(F=18.42,P﹤0.01;F=79.92,P﹤0.01;F=306.47,P﹤0.01)、迁移(F=128.42,P﹤0.01;F=90.41,P﹤0.01)、侵袭(F=632.01,P﹤0.01)能力受抑制。过表达组的细胞周期被阻滞在G0/G1期(F=26.32,P﹤0.01)。***-Long过表达后可能通过下调PI3K-AKT-NF-kB信号通路发挥肿瘤抑制作用。PTEN-Long过表达组与对照组及空载组相比较,RT-PCR实验结果显示过表达组的NF-κB p65(F=53.32,P﹤0.01)、bcl-xl(F=933.88,P﹤0.01)表达水平降低,IκBα(F=26.61,P﹤0.01)表达水平增加;Western blot实验结果显示过表达组的p-Akt(F=56.19,P﹤0.01)、NF-κB p65(F=43.65,P﹤0.01)、p-NF-κB p65(F=114.68,P﹤0.01)、bcl-xl(F=19.26,P﹤0.01)表达水平降低,IκBα(F=45.23,P﹤0.01)表达水平增加。***-Long过表达后,裸鼠皮下U251细胞增殖能力被抑制,其机制可能与下调PI3K-AKT-NF-kB信号通路有关。与对照组及空载组相比较,过表达组裸鼠一般情况稍好,皮下肿瘤体积(F=369.1,P0.01)及重量(F=27.71,P0.01)较小。免疫组化染色结果为:过表达组细胞中PTEN-Long(F=25.33,P0.01)表达量增加,p-Akt(F=21.50,P0.01)、NF-κB p65(F=10.96,P0.01)表达量降低。结论:***-Long过表达后在体外细胞水平可以抑制人胶质瘤细胞U251增殖、迁移及侵袭,并将细胞周期阻滞在G0/G1期,诱导细胞凋亡。***-Long过表达后在体内水平可以抑制裸鼠皮下异体移植胶质细胞瘤的生长。***-Long可以发挥肿瘤抑制作用,其机制可能与下调PI3K-AKT-NF-kB信号通路有关,PTEN-Long有可能成为胶质瘤基因治疗的新靶点,为基因治疗提供新方向。