Hsa-miR-4282通过调控GRB2抑制肝癌细胞增殖、侵袭、迁移能力

作     者：王汇锋 

作者单位：广西医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：黎乐群

授予年度：2019年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：Hsa-miR-4282 SMMC-7721 肝细胞癌 增殖 凋亡 迁移 侵袭 GRB2 Ras EGFR 

摘      要：第一章Hsa-miR-4282在肝细胞癌中的表达目的:通过对miR-4282在不同肝组织及细胞中的表达量的验证,探究miR-4282在肝癌和正常组织中表达量是否存在差异。方法:通过收集临床中肝癌患者的手术标本,采用Trizol法提取组织和细胞系的总RNA,利用qRT-PCR方法定量检测miR-4282在肝癌组织和其对应癌旁组织中,肝癌细胞系MHCC97-H、SMMC-7721和肝上皮细胞系HL-7702中的表达水平。结果:miR-4282在肝癌组织中的表达量显著低于癌旁组织(0.680±0.350 vs 1.006±0.108,P=0.001),肝癌细胞系MHCC97-H、SMMC-7721中的表达量也显著低于正常肝上皮细胞系HL-7702(0.520±0.050 vs 0.410±0.070 vs 1.003±0.079,P=0.005,P=0.001)。结论:相比在正常肝细胞和癌旁组织的表达量,miR-4282在肝癌细胞和肝癌组织中显著降低。第二章Hsa-miR-4282不同表达水平对肝癌细胞生物学功能的影响目的:通过转染使miR-4282低表达及高表达,并通过体外细胞功能实验,验证miR-4282升高或降低使肝癌细胞系SMMC-7721的细胞功能变化。方法:利用瞬时转染miR-4282 mimics、inhibitor使miR-4282在肝癌细胞系SMMC-7721中上调及下调。瞬时转染后48h提取细胞总RNA,逆转录后采用q RT-PCR方法验证转染表达量。通过MTT法验证高表达及低表达miR-4282对SMMC-7721细胞增殖能力的影响;平板克隆形成实验验证miR-4282表达量变化对细胞克隆形成能力的影响;流式细胞术凋亡实验验证miR-4282对细胞凋亡率的影响;Transwell迁移实验及细胞划痕实验验证miR-4282对细胞横向及纵向迁移能力的影响;Transwell侵袭实验验证侵袭能力通过转染miR-4282后产生的变化。最后通过统计学分析得出miR-4282高表达及低表达对SMMC-7721细胞侵袭、增殖、克隆、凋亡功能是否产生影响。结果:转染miR-4282 mimics、inhibitor后,上调组的表达量高于对照组(28.326±2.301 vs 1.052±0.0854,P=0.004),下调组表达量低于对照组(0.287±0.037 vs 1.075±0.193,P=0.001)。通过MTT实验,miR-4282上调组的OD值小于阴性对照组(P0.01),下调组的OD值大于阴性对照组(P0.01)。平板克隆形成实验,miR-4282上调组克隆数低于对照组(146±10 vs 193±12,P=0.013),下调组克隆数高于对照组(240±7 vs 191±10,P=0.005)。细胞凋亡实验,相较对照组miR-4282上调组细胞凋亡率增加(23.887%±1.885%vs 16.600%±1.141%,P=0.009),而下调组凋亡率下降(14.977%±0.460%vs 17.790%±0.725%,P=0.010)。细胞划痕实验中miR-4282上调组愈合率减慢而下调组愈合率显著加快(P0.05)。Transwell迁移实验中miR-4282上调细胞迁移个数较对照组减少(8±3 vs 30±4,P0.001),下调迁移个数较对照组增多(45±5 vs 31±9,P=0.000)。Transwell侵袭实验中miR-4282上调后穿过小室膜的细胞数小于对照组(12±7 vs 24±2,P0.001),miR-4282下调后穿过小室的细胞数大于对照组(34±8 vs 20±3,P0.001)。结论:下调miR-4282的表达可增强肝癌细胞系SMMC-7721的增殖、迁移、侵袭能力,抑制凋亡。miR-4282在正常肝细胞中具有抑癌作用。第三章Hsa-miR-4282的互作基因预测及其作用机制目的:研究miR-4282引起肝癌细胞增殖、侵袭、转移功能变化的机制。方法:通过生物信息学分析,应用Targetscan等网站预测与miR-4282的相互作用的相关基因,并通过KEGG PATHWAY中根据上两部分的功能选择合适的相关基因及通路,并通过双荧光素酶报告系统验证相互作用关系。应用q RT-PCR验证上调及下调miR-4282对该基因的表达量产生何种影响,再通过STRING及之前生物信息学分析的通路查找与靶基因互作的蛋白,通过Westernblot及q RT-PCR方法验证该基因及同名蛋白在miR-4282上调及下调后的表达情况变化。结果:通过生物信息学分析,我们找到了GRB2这个基因作为研究对象,通过双荧光素酶报告验证,结果显示GRB2基因与miR-4282存在相互作用关系,再通过q RT-PCR验证GRB2表达量变化,结果为当miR-4282上调时GRB2表达量下降(0.499±0.150 vs 1.397±0.632,P=0.009),反之GRB2表达量升高(1.726±0.198 vs 0.965±0.129,P=0.035)。通过STRING网站及KEGG PATHWAY分析后我们发现了EGFR与GRB2存在蛋白相互作用并可影响细胞增殖功能,结果显示同GRB2基因一致,EGFR基因在当miR-4282上调时表达量下降(0.288±0.115 vs 1.097±0.120,P=0.013),反之EGFR表达量升高(1.726±0.198 vs 0.965±0.129,P=0.035),同名蛋白的表达与基因一致,上调组(0.500±0.121 vs 1.160±0.246,P=0.027);下调组(1.605±0.256 vs 0.958±0.110,P=0.030)。GRB2可通过ERBB通路影响细胞的侵袭迁移能力,我们在通路中选择了Ras蛋白作为下游蛋白验证对象,结果显示Ras蛋白在miR-4282低表达时高表达(1.503±0.187 vs0.994±0.918,P=0.026),在miR-4282高表达时表达量明显下降(0.639±0.075 vs 1.164±0.193,P=0.023)。结论:在肝癌细胞中低表达水平的miR-4282促进细胞增殖、侵袭、迁移,miR-4282通过GRB2调控Ras/EGFR表达水平,增强SMMC-7721细胞增殖、侵袭、迁移能力。