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鼠miR-763通过靶向GRB2抑制人黑色素瘤细胞的增殖和迁移的机制研究

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鼠miR-763通过靶向GRB2抑制人黑色素瘤细胞的增殖和迁移的机制研究

作者：李晶晶新乡医学院

学位级别：硕士

背景恶性黑色素瘤属于皮肤癌,具有高转移性并难以治愈。手术是早期的黑色素瘤患者的首要治疗方法,大多数到了晚期的患者一般是放化疗和生物靶向治疗,但其预后表现很差。微小核糖核酸(miRNAs)在人类癌症继发性过程中参与调节关键基因的... 详细信息

背景恶性黑色素瘤属于皮肤癌,具有高转移性并难以治愈。手术是早期的黑色素瘤患者的首要治疗方法,大多数到了晚期的患者一般是放化疗和生物靶向治疗,但其预后表现很差。微小核糖核酸(miRNAs)在人类癌症继发性过程中参与调节关键基因的表达并在多种细胞活动中起着重要作用,它可严格控制目标基因的表达并调节细胞的基本功能。前期研究表明,在增殖能力较强的鼠黑色素瘤细胞B16F10中,miR-763的表达水平明显降低,并且应用生物信息学软件预测GRB2可能是其目标基因,提示miR-763可能具有抗肿瘤活性。然而,miR-763发挥作用的具体机制还尚不清楚。GRB2是一种25 KD的接头蛋白,最初发现是参与完成细胞生长、细胞增殖和新陈代谢等基本细胞活动。最近的研究证明GRB2在多种恶性肿瘤中起重要作用,但其在黑色素瘤中的生物学作用尚不明确。因此,我们深入研究鼠miR-763在人黑色素瘤细胞中是否具有肿瘤抑制作用及其发挥作用的具体分子机制,这将有助于为黑色素瘤患者设计和研发新的药物。目的1.探究miR-763对人黑色素瘤细胞的增殖和迁移能力的影响;2.深入探讨miR-763是否靶向人GRB2基因以及发挥抗肿瘤作用的具体分子机制。方法1.miR-763过表达的稳转细胞系的筛选:miR-763过表达与对照组慢病毒感染人黑色素瘤细胞SK-MEL-5和SK-MEL-28,用puromycin筛选稳转细胞系,观察是否有绿色荧光来指示慢病毒感染细胞模型是否构建成功;2.miR-763高表达对黑色素瘤细胞增殖和迁移的影响:用稳转细胞系进行CCK8实验和Transwell小室实验,观察细胞增殖和迁移能力是否有变化;3.检测GRB2是否为miR-763的靶基因:利用双荧光素酶实验和Western blot检测miR-763对GRB2表达的影响;4.miR-763是否靶向GRB2发挥对黑色素瘤的抑制作用:在黑色素瘤细胞SK-MEL-5和SK-MEL-28中将miR-763均过表达,进行CCK8实验和Transwell小室实验,检测miR-763是否通过GRB2发挥对黑色素瘤的抑制作用;5.miR-763在人黑色素瘤细胞中发挥作用的具体机制:用Western blot检测GRB2下游信号分子cyclin D3的蛋白表达水平和p38的磷酸化水平的变化;6.动物实验检测miR-763过表达对体内黑色素瘤生长的影响:构建裸鼠皮下移植瘤模型,观测并记录肿瘤生长情况,并且提取肿瘤组织蛋白进行Western blot实验检测GRB2下游信号分子蛋白的表达水平。结果1.在人黑色素瘤细胞的稳转细胞系中,miR-763过表达组细胞相比于对照组,其增殖和迁移能力减弱,表明miR-763过表达可能抑制人黑色素瘤细胞SK-MEL-5和SK-MEL-28的增殖和迁移能力。2.双荧光素酶实验证明鼠miR-763和GRB2之间存在靶向关系,并且miR-763过表达下调了GRB2的蛋白表达水平。GRB2过表达能够逆转miR-763 mimic诱导的增殖和迁移的抑制,进一步证明GRB2是miR-763的靶基因。3.通过Western blot实验分析发现miR-763过表达下调了GRB2的下游信号分子cyclin D3的蛋白表达水平和p38的磷酸化水平,证明miR-763通过介导p38 MAPK信号通路发挥对黑色素瘤的抑制作用。4.裸鼠体内实验结果显示,miR-763过表达组肿瘤体积和重量均小于对照组,并且肿瘤组织的Western blot实验结果显示,miR-763过表达下调了GRB2下游信号分子cyclin D3的蛋白表达水平和p38的磷酸化水平,证明miR-763过表达抑制裸鼠黑色素瘤的生长。结论本研究发现了鼠miR-763过表达抑制人黑色素瘤细胞的增殖和迁移能力,并进一步证明GRB2是miR-763的靶基因。miR-763发挥抗肿瘤作用可能是通过靶向GRB2调节p38 MAPK信号通路进而抑制人恶性黑色素瘤细胞的增殖和迁移。因此,这些结果可能在黑色素瘤治疗中有助于药物的研发。

关键词： miR-763 GRB2 黑色素瘤增殖迁移

卵形鲳鲹CD28共刺激信号通路相关基因克隆与表达分析

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卵形鲳鲹CD28共刺激信号通路相关基因克隆与表达分析

作者：何金全广西大学

学位级别：硕士

T细胞作为适应性免疫系统的重要组成部分,其完全激活不仅需要T细胞表面受体提供第一信号,而且需要CD28共刺激受体提供第二个信号,才能充分使其活化。CD28共刺激信号通过招募GRB2,后者通过与Vav1和SLP-76相互作用,介导下游信号级联传递,... 详细信息

T细胞作为适应性免疫系统的重要组成部分,其完全激活不仅需要T细胞表面受体提供第一信号,而且需要CD28共刺激受体提供第二个信号,才能充分使其活化。CD28共刺激信号通过招募GRB2,后者通过与Vav1和SLP-76相互作用,介导下游信号级联传递,增强T细胞的激活和分化,在调节免疫反应中发挥重要作用。卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)是我国南方重要的海水养殖鱼类。随着卵形鲳鲹养殖业的不断扩大,病害问题逐年增加,严重威胁到卵形鲳鲹的健康养殖。本研究从健康卵形鲳鲹的脾脏组织克隆获得卵形鲳鲹CD28、GRB2、Vav1和SLP-76基因(命名为TroCD28、TroGRB2、TroVav1和TroSLP-76)全长序列并进行生物信息学分析;利用荧光定量PCR分析TroCD28、TroGRB2、TroVav1和TroSLP-76在健康组织和免疫刺激后的组织的表达量变化;运用亚细胞定位和Co-IP探究TroCD28、TroGRB2和TroSLP-76在HEK-293T细胞中的定位及相互作用;最后通过原核表达系统对TroCD28胞外域、TroGRB2和TroSLP-76进行蛋白表达。本研究的主要结果如下:(1)TroCD28、TroGRB2、TroVav1、TroSLP-76基因全长分别为1362bp、1580 bp、2861 bp和2373 bp,分别编码248、217、844和375个氨基酸;4个基因的推定氨基酸包含与其他脊椎动物相似的保守基序;同源性分析表明,TroCD28、TroGRB2、TroVav1、TroSLP-76均与其他鱼类同源氨基酸序列相似度高,分别为68.95%～25.00%、100%～93.09%、95.73%～76.71%和92.90%～30.22%。系统发育树分析显示,TroCD28、TroGRB2、TroVav1和TroSLP-76与鱼类聚为一枝。这表明4个基因在不同鱼类中相对保守。(2)qRT-PCR分析显示,TroCD28、TroGRB2、TroVav1和TroSLP-76在卵形鲳鲹的所有检查组织中表达,但它们的转录水平在不同组织中不同,其中TroCD28在鳃中的表达最高,TroGRB2和TroVav1在脾脏中表达最高,TroSLP-76在肠道中的表达量最高;(3)在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)、多聚肌胞苷酸(polyriboinosinic-polyribocytidylic acid,poly I:C)和溶藻弧菌(V.alginolyticus)刺激后,TroCD28和TroGRB2在头肾和脾脏中的表达量显著上升。在PBLs,TroCD28被LPS和Poly I:C诱导显著上升,但V.alginolyticus刺激后无明显变化。TroGRB2在LPS刺激后24 h的PBLs显著上升,但是Poly I:C和V.alginolyticus刺激后无明显变化。LPS、Poly I:C和V.alginolyticus刺激后,TroVav1在脾脏和PBLs显著上升。在头肾中,TroVav1可以被LPS、Poly I:C诱导表达,但V.alginolyticus刺激后则无显著变化。LPS、Poly I:C和V.alginolyticus刺激后,TroSLP-76在头肾、脾脏和PBLs显著上调。这表明4个基因均参与了卵形鲳鲹的免疫反应过程。(4)亚细胞定位结果显示,TroCD28定位在细胞膜,TroGRB2和TroSLP-76定位在细胞质;(5)Co-IP结果显示,TroGRB2与TroCD28存在相互作用,但不与TroSLP-76相互作用;(6)通过原核表达获得纯度较高的TroCD28胞外域、TroGRB2和TroSLP-76重组蛋白,为进一步制备抗体,研究它们的配体和功能奠定基础。综上所述,本研究结果将为更深入地研究卵形鲳鲹T细胞活化机制,制定病害防控新策略和抗病育种奠定理论基础。

关键词：卵形鲳鲹 CD28 GRB2 Vav1 SLP-76 共刺激信号基因克隆

人GRB2基因真核表达及其在293T细胞中的定位研究

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生物技术 2016年第5期26卷 450-455页

作者：熊玉锋郝文波张佳凤陈达香徐岚李明南方医科大学生物技术学院抗体工程研究所广东广州510515

[目的]构建人GRB2蛋白真核表达质粒p Enter-GRB2,并观察其在293T细胞中的定位。[方法]从Hela细胞中提取总RNA,通过RT-PCR获得GRB2全长c DNA序列,并将其克隆到真核表达载体p Enter中,构建重组质粒p Enter-GRB2。转染293T细胞24 h、36 h和... 详细信息

[目的]构建人GRB2蛋白真核表达质粒p Enter-GRB2,并观察其在293T细胞中的定位。[方法]从Hela细胞中提取总RNA,通过RT-PCR获得GRB2全长c DNA序列,并将其克隆到真核表达载体p Enter中,构建重组质粒p Enter-GRB2。转染293T细胞24 h、36 h和48 h后通过Western Blot检测其表达情况,通过免疫荧光观察其在细胞中的定位情况。[结果]经双酶切及测序鉴定,GRB2开放阅读框正确地构建到了真核表达质粒p Enter中,免疫印迹检测可见大小约为25 k Da的特异性条带,免疫荧光实验表明GRB2蛋白在细胞质和细胞核中均存在。[结论]成功构建了真核表达质粒p Enter-GRB2并在293T细胞中表达,证实GRB2在293T细胞中不仅存在于细胞质中,也存在于细胞核中,为更加深入地研究其生物学功能及机制奠定了理论基础。

关键词： GRB2 293T 真核表达定位

IGF1R、SHC1、GRB2、MST1及MDM2在脂溢性角化病、鲍恩病、皮肤鳞状细胞癌中的表达及意义

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IGF1R、SHC1、GRB2、MST1及MDM2在脂溢性角化病、鲍恩病、皮肤鳞...

作者：王翠芹承德医学院

学位级别：硕士

目的:近年来皮肤肿瘤的发病率逐年增高,不但给人们的生命健康带来了严重的威胁,还给人们的经济带来了沉重的负担,因此积极探讨皮肤肿瘤的发病机制,积极寻找皮肤肿瘤发病过程中的特异性指标至关重要。本研究探讨IGF1R、SHC1、GRB2、MST1... 详细信息

目的:近年来皮肤肿瘤的发病率逐年增高,不但给人们的生命健康带来了严重的威胁,还给人们的经济带来了沉重的负担,因此积极探讨皮肤肿瘤的发病机制,积极寻找皮肤肿瘤发病过程中的特异性指标至关重要。本研究探讨IGF1R、SHC1、GRB2、MST1及MDM2在脂溢性角化病(seborrheic keratosis,SK)、鲍恩病(Bowen’s disease,BD)、皮肤鳞状细胞癌(cutaneous squamous cell carcinoma,cSCC)组织中的表达水平,并分析其意义,以期为皮肤肿瘤的早期诊断、鉴别或预后提供理论基础。方法:1收集承德医学院附属医院及沧州市中心医院手术切除的50例SK、20例BD、22例cSCC组织蜡块标本及10例色素痣周围正常皮肤组织,采用免疫组织化学SP染色法检测上述四组组织中IGF1R、SHC1、GRB2、MST1及MDM2的表达情况。2数据处理采用SPSS19.0软件,计数资料以n(%)表示,阳性率之间比较采用Pearsonχ2检验、连续性校正χ2检验或Fisher确切概率法;以P2/50)、90.00%(18/20)、90.91%(20/22)。cSCC组、BD组、SK组阳性率均高于正常组(P均0.05)。(Tab.1)2 SHC1在正常组及SK组、BD组、cSCC组患者皮损中的阳性率依次0(0/10)、88.00%(44/50)、100.00%(20/20)、95.45%(21/22)。cSCC组、BD组、SK组阳性率均高于正常组(P均0.05)。(Tab.2)3 GRB2在正常组及SK组、BD组、cSCC组患者皮损中的阳性率依次为0(0/10)、18.00%(9/50)、55.00%(11/20)、72.73%(16/22)。cSCC组和BD组阳性率高于SK组和正常组(P均0.05)。(Tab.3)4 MST1在正常组及SK组、BD组、cSCC组患者皮损中的阳性率依次为100.00%(10/10)、80.00%(40/50)、95.00%(19/20)、72.73%(16/22),各组间阳性率两两比较比较差异无统计学意义(P均>0.05)。(Tab.4)5 MDM2在正常组及SK组、BD组、cSCC组患者皮损中的阳性率依次为0(0/10)、74.00%(37/50)、100.00%(20/20)、100.00%(22/22)。cSCC组、BD组、SK组阳性率均高于正常组(P均2 SHC1在cSCC组、BD组、SK组的阳性表达率均明显高于正常组,差异有统计学意义,说明SHC1可能在脂溢性角化病、皮肤原位鳞癌及皮肤浸润性鳞癌中存在异常活化;SHC1的阳性表达率在SK组、BD组、cSCC组相互之间比较差异无统计学意义,说明SHC1可能对表皮角质形成细胞的增生有促进作用,而对其间变、恶变、侵袭、转移无明显促进作用。3 GRB2的阳性表达率在cSCC组和BD组均明显高于SK组和正常组,且差异有统计学意义,但SK组与正常组阳性率相比,差异无统计学意义,表明GRB2可能参与了皮肤鳞状细胞癌的发生,而在脂溢性角化病这一良性肿瘤中作用不明显;cSCC组与BD组阳性率比较,差异无统计学意义,提示GRB2可能尚不能对皮肤鳞状细胞癌是否发生侵袭转移做出预示。4 MST1的阳性表达率在正常组、SK组、BD组及cSCC组组间多重比较中差异无统计学意义,表明MST1可能未参与脂溢性角化病和皮肤鳞状细胞癌的发生发展。5 MDM2的阳性表达率在cSCC组、BD组、SK组均高于正常组,且差异有统计学意义,提示MDM2表达上调可能在上述表皮增生性肿瘤的发生发展中起促进作用;cSCC组、BD组阳性率均高于SK组,且差异有统计

关键词： IGF1R SHC1 GRB2 MST1 MDM2 皮肤肿瘤

Hey1上调GRB2激活PI3K/AKT信号途径促进黑色素瘤细胞的迀移和侵袭

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Hey1上调GRB2激活PI3K/AKT信号途径促进黑色素瘤细胞的迀移和侵袭

作者：蒲以欢重庆医科大学

学位级别：硕士

目的:含有YRPW基序1的Hes相关家族b HLH转录因子（Hey1）被认为是Notch信号通路的靶基因,有越来越多的研究证据都在表明Notch信号通路在恶性黑色素瘤的多种细胞生物学过程起重要的调节作用。Hey1作为Notch信号的靶基因,并是广泛的转录因... 详细信息

目的:含有YRPW基序1的Hes相关家族b HLH转录因子（Hey1）被认为是Notch信号通路的靶基因,有越来越多的研究证据都在表明Notch信号通路在恶性黑色素瘤的多种细胞生物学过程起重要的调节作用。Hey1作为Notch信号的靶基因,并是广泛的转录因子,在多种肿瘤如乳腺癌、卵巢癌、骨肉瘤等的发生发展中都起着重要作用,但其在黑色素瘤细胞中的作用及其机制却被忽视。检测Hey1对黑素瘤细胞的生物学功能影响及探讨其可能的潜在作用机制是本研究的主要目的所在。方法:我们使用生物信息学工具、免疫组织化学和western blot分析方法来评估黑色素瘤中Hey1的表达情况;细胞体外和裸鼠体内实验用于确定Hey1对黑色素瘤恶性行为的影响;高通量测序方法用于检测干扰Hey1后的黑素瘤细胞差异表达基因,KEGG通路富集被用于分析差异基因参与的信号通路;免疫荧光法用于检测Hey1和GRB2在黑素瘤中的共表达情况;Western blot被用于检测干扰或过表达Hey1后,上皮-间叶转化过程（EMT）中的相关蛋白、基质金属蛋白酶（MMPs）以及GRB2/PI3K/AKT信号途径中关键信号分子蛋白表达水平发生了怎样的改变。结果:Hey1在黑素瘤组织以及黑素瘤细胞系中的表达水平均明显上调。在细胞实验中,干扰Hey1显著抑制了黑素瘤细胞的体外迁移和侵袭过程,同时涉及上皮-间叶转化过程的E-cadherin表达量增高,N-cadherin、Vimentin、Snail表达量降低,另外基质金属蛋白酶MMP2、MMP7和MMP9表达量也同时降低,而Hey1过表达组结果呈现与Hey1干扰组相反的趋势。随后,在体外异种移植动物模型中,与对照组相比,Hey1干扰组的原位肿瘤体积明显减小,未查见肺转移瘤;而Hey1过表达组原位肿瘤体积明显增大,肺转移瘤数量多体积更大。最后,高通量测序鉴定出干扰Hey1的A375细胞中总共232个差异编码基因,KEGG富集结果提示GRB2/PI3K/AKT有显著差异,我们通过Western blot进行了验证,在两组结果中,AKT、PI3K蛋白水平变化不显著,但干扰组中GRB2、p-PI3K、p-AKT（ser308）、P-P21蛋白水平显著降低,而过表达组中GRB2、p-PI3K、p-AKT（ser308）、P-P21蛋白水平显著增高。结论:Hey1可以促进黑色素瘤的侵袭和转移过程,但其作用可能并不局限于我们当前的研究结果。此外,Hey1被认为是NOTCH信号的效应因子,但本研究表明Hey1可以通过上调GRB2激活PI3K/AKT信号途径,使其中的关键信号分子的蛋白表达水平。由此,我们推测Hey1有可能在Notch信号途径与其他信号途径的相互串扰过程中起着重要的介导作用。

关键词：黑素瘤 Hey1 GRB2 PI3K/AKT信号途径迁移和侵袭

Hsa-miR-4282通过调控GRB2抑制肝癌细胞增殖、侵袭、迁移能力

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Hsa-miR-4282通过调控GRB2抑制肝癌细胞增殖、侵袭、迁移能力

作者：王汇锋广西医科大学

学位级别：硕士

第一章Hsa-miR-4282在肝细胞癌中的表达目的:通过对miR-4282在不同肝组织及细胞中的表达量的验证,探究miR-4282在肝癌和正常组织中表达量是否存在差异。方法:通过收集临床中肝癌患者的手术标本,采用Trizol法提取组织和细胞系的总RNA,利... 详细信息

第一章Hsa-miR-4282在肝细胞癌中的表达目的:通过对miR-4282在不同肝组织及细胞中的表达量的验证,探究miR-4282在肝癌和正常组织中表达量是否存在差异。方法:通过收集临床中肝癌患者的手术标本,采用Trizol法提取组织和细胞系的总RNA,利用qRT-PCR方法定量检测miR-4282在肝癌组织和其对应癌旁组织中,肝癌细胞系MHCC97-H、SMMC-7721和肝上皮细胞系HL-7702中的表达水平。结果:miR-4282在肝癌组织中的表达量显著低于癌旁组织(0.680±0.350 vs 1.006±0.108,P=0.001),肝癌细胞系MHCC97-H、SMMC-7721中的表达量也显著低于正常肝上皮细胞系HL-7702(0.520±0.050 vs 0.410±0.070 vs 1.003±0.079,P=0.005,P=0.001)。结论:相比在正常肝细胞和癌旁组织的表达量,miR-4282在肝癌细胞和肝癌组织中显著降低。第二章Hsa-miR-4282不同表达水平对肝癌细胞生物学功能的影响目的:通过转染使miR-4282低表达及高表达,并通过体外细胞功能实验,验证miR-4282升高或降低使肝癌细胞系SMMC-7721的细胞功能变化。方法:利用瞬时转染miR-4282 mimics、inhibitor使miR-4282在肝癌细胞系SMMC-7721中上调及下调。瞬时转染后48h提取细胞总RNA,逆转录后采用q RT-PCR方法验证转染表达量。通过MTT法验证高表达及低表达miR-4282对SMMC-7721细胞增殖能力的影响;平板克隆形成实验验证miR-4282表达量变化对细胞克隆形成能力的影响;流式细胞术凋亡实验验证miR-4282对细胞凋亡率的影响;Transwell迁移实验及细胞划痕实验验证miR-4282对细胞横向及纵向迁移能力的影响;Transwell侵袭实验验证侵袭能力通过转染miR-4282后产生的变化。最后通过统计学分析得出miR-4282高表达及低表达对SMMC-7721细胞侵袭、增殖、克隆、凋亡功能是否产生影响。结果:转染miR-4282 mimics、inhibitor后,上调组的表达量高于对照组(28.326±2.301 vs 1.052±0.0854,P=0.004),下调组表达量低于对照组(0.287±0.037 vs 1.075±0.193,P=0.001)。通过MTT实验,miR-4282上调组的OD值小于阴性对照组(P282上调组克隆数低于对照组(146±10 vs 193±12,P=0.013),下调组克隆数高于对照组(240±7 vs 191±10,P=0.005)。细胞凋亡实验,相较对照组miR-4282上调组细胞凋亡率增加(23.887%±1.885%vs 16.600%±1.141%,P=0.009),而下调组凋亡率下降(14.977%±0.460%vs 17.790%±0.725%,P=0.010)。细胞划痕实验中miR-4282上调组愈合率减慢而下调组愈合率显著加快(P282上调细胞迁移个数较对照组减少(8±3 vs 30±4,P282上调后穿过小室膜的细胞数小于对照组(12±7 vs 24±2,P282下调后穿过小室的细胞数大于对照组(34±8 vs 20±3,P282的表达可增强肝癌细胞系SMMC-7721的增殖、迁移、侵袭能力,抑制凋亡。miR-4282在正常肝细胞中具有抑癌作用。第三章Hsa-miR-4282的互作基因预测及其作用机制目的:研究miR-4282引起肝癌细胞增殖、侵袭、转移功能变化的机制。方法:通过生物信息学分析,应用Targetscan等网站预测与miR-4282的相互作用的相关基因,并通过KEGG PATHWAY中根据上两部分的功能选择合适的相关基因及通路,并通过双荧光素酶报告系统验证相互作用关系。应用q RT-PCR验证上调及下调miR-4282对该基因的表达量产生何种影响,再通过STRING及之前生物信息学分析的通路查找与靶基因互作的蛋白,通过Westernblot及q RT-PCR方法验证该基因及同名蛋白在miR-4282上调及下调后的表达情况变化。结果:通过生物信息学分析,我们找到了GRB2这个基因作为研究对象,通过双荧光素酶报告验证,结果显示GRB2基因与miR-4282存在相互作用关系,再通过q RT-PCR验证GRB2表达量变化,结果为当miR-4282上调时GRB2表达量下降(0.499±

关键词： Hsa-miR-4282 SMMC-7721 肝细胞癌增殖凋亡迁移侵袭 GRB2 Ras EGFR

不同杂交组合鹅的产蛋性能差异比较及GRB2和SOS基因表达规律研究

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不同杂交组合鹅的产蛋性能差异比较及GRB2和SOS基因表达规律研究

作者：李书哲吉林农业大学

学位级别：硕士

我国养鹅业一直存在着生产性能较为低下的情况,同时也是制约其快速发展的原因之一,如何提高其产蛋性能是目前遗传育种主要的研究方向。近年来很多研究者们借助分子生物学技术探讨某些功能基因在卵泡中是否表达或者在不同时期的差异表达... 详细信息

我国养鹅业一直存在着生产性能较为低下的情况,同时也是制约其快速发展的原因之一,如何提高其产蛋性能是目前遗传育种主要的研究方向。近年来很多研究者们借助分子生物学技术探讨某些功能基因在卵泡中是否表达或者在不同时期的差异表达情况,进而阐述其直接或者间接对产蛋性能的影响。因此,本研究将传统育种方法和现代分子生物学技术相结合,来研究某些基因与产蛋性能之间的关系。本研究以第Ⅰ组(籽纯繁)、第Ⅱ组(卡♂×F1♀)、第Ⅲ组(F1♂×籽♀)、第Ⅳ组(卡纯繁)4组不同杂交组合的试验鹅为研究对象,通过杂交育种筛选出各项产蛋性能指标优良的杂交组合,通过荧光定量PCR技术和Western Blot技术研究ERK信号通路中的关键基因GRB2和SOS基因在鹅等级前卵泡mRNA和蛋白质水平上的表达情况。研究结果如下:(1)通过杂交试验测定不同杂交组合平均产蛋量、平均蛋重、蛋形指数、孵化率受精率等指标,结果发现第Ⅰ组的平均产蛋量最高可达到82.13±4.04枚,显著高于其他试验组(p2%、78.44%±7.84%、82.33%±9.66%、68.61%±2.99%,且第Ⅰ组、第Ⅱ组、第Ⅲ组种蛋平均受精率均显著高于第Ⅳ组(p2)通过荧光定量PCR发现籽鹅产蛋高峰期等级前卵泡中ERK信号通路上的两个重要基因GRB2、SOS在mRNA水平上均有表达,GRB2基因在PE等级卵泡中表达量最高达到66.62±1.8,在M等级卵泡中表达量最低为31.61±0.82,且存在显著的差异性(p2±0.04,且差异显著(pGRB2在L等级卵泡中表达量最高达到2.33±0.01,在M等级卵泡中表达量最低为1.25±0.02,且差异性显著(p2.137±0.02,在SY中表达量最低为1.023±0.01且显著低于在其他等级卵泡中的表达量(pGRB2和SOS与卵泡发育过程具有一定的关联,主要通过调节细胞的增殖分化来调节卵泡的发育。

关键词：籽鹅产蛋性能等级前卵泡 GRB2 SOS

生长因子受体结合蛋白2（GRB2）与结直肠癌发生及预后的关系

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生长因子受体结合蛋白2（GRB2）与结直肠癌发生及预后的关系

作者：康争春第二军医大学

学位级别：硕士

结直肠癌是临床发病率逐年上升并严重威胁人类生命的恶性肿瘤,近年来,由于环境、遗传因素、生活方式、饮食结构的变化及社会心理因素的综合影响,结直肠癌的发病率及死亡率逐年攀升。目前大约每年有120万以上的病人被确诊为结直肠癌,其... 详细信息

结直肠癌是临床发病率逐年上升并严重威胁人类生命的恶性肿瘤,近年来,由于环境、遗传因素、生活方式、饮食结构的变化及社会心理因素的综合影响,结直肠癌的发病率及死亡率逐年攀升。目前大约每年有120万以上的病人被确诊为结直肠癌,其中高达60多万人死于结直肠癌。结直肠癌中男性病人所占比例高于女性,中老年患者所占比例高于青少年。目前观点认为结直肠癌是由正常的结直肠细胞经过基因的甲基化等修饰造成基因突变,逐渐由腺瘤恶变为癌症。目前广泛调查统计发现结直肠癌发病呈现由左向右发展的趋势。目前针对结直肠癌的治疗已经从最初的手术治疗发展为结合了手术治疗、化学治疗、靶向治疗等治疗方式的综合治疗。对外科手术治疗后的患者采用化疗可以有效的预防癌症复发,但是化疗本身又有不可避免的副作用,过度化疗对患者可能产生比癌症更为不利的影响。综上所述,能发现结直肠癌的有效生物标志物作为诊断和预测疾病的依据,为结直肠癌患者提供合理有效的治疗方案尤为重要。目前,结直肠癌的治疗方案和预后主要根据其临床病理分期判断。但是,根据调查统计发现分期一致的患者生存时间长短差别却很大,一些分期尚好的患者术后较早的出现了癌症的复发。近些年来,结直肠癌的分子标志物成为热点,研究发现的分子标志物层出不穷,但往往特异性较差,临床应用价值较低。因此,寻找特异性较好、临床应用价值较高的分子标志物成为研究热点。生长因子受体结合蛋白2(growth factor receptor bound protein 2,GRB2)作为一种在酪氨酸激酶受体信号通路发挥重要衔接作用的蛋白,其表达水平的高低直接影响细胞的增殖、分化。在目前发表的文献中证实GRB2在多种恶性肿瘤中均有异常表达,并且对患者的生存预后、治疗方案有指导意义。本研究采用了我院样本量较大、病历较完整、随访时间相对较长的临床病理样本及患者相关资料,用免疫组织化学、RT-PCR以及Western-blot技术及方法,探究GRB2蛋白与结直肠癌发生及预后的关系。第一部分GRB2的表达与结直肠癌发生及预后的关系目的:评价生长因子受体结合蛋白2(GRB2)表达水平与结直肠癌发生及预后的相关关系。方法:利用我院普外科建立的结直肠癌组织芯片(其中341例具有完整的复发及生存信息)对GRB2的蛋白表达及细胞定位进行免疫组化检测,结合患者的临床信息,用t检验、chi-square检验等比较GRB2的表达与年龄、性别、疾病部位、分化等级、淋巴结个数、TNM分期、辅助化疗、CEA和CA19-9之间的关系。运用Kaplan-Meier分析,研究GRB2的表达水平是否影响患者的生存时间;运用Cox回归的单因素和多因素分析模型,探究影响结直肠癌预后效果的因素。结果:GRB2主要表达于结直肠上皮细胞的胞浆,胞浆GRB2在结直肠癌组织中显著高于息肉和癌旁组织(PGRB2在胞核的表达水平无显著差异;癌上皮中胞浆GRB2高表达与年龄、性别、疾病部位、分化等级、TNM分期、辅助化疗、Serum CEA和Serum CA19-9之间均无关,胞浆GRB2高表达与淋巴结个数之间有显著差异。单因素分析发现胞浆GRB2高表达显著预测患者的不良预后,进一步纳入TNM分期等指标,多因素COX模型发现GRB2是结直肠癌独立的预后影响因素(无病生存HR=2.664,P=0.015;总体生存HR=2.574,P=0.019)。结论:GRB2高表达与结直肠癌发生密切相关,是结直肠癌预后不良的独立影响因素。第二部分GRB2促进结直肠细胞增殖能力目的:评价GRB2对结直肠细胞增殖能力的影响。方法:采用Western blot和RT-PCR法检测GRB2 siRNA转染效率;采用克隆形成和CCK8法检测GRB2敲低后结直肠癌细胞的增殖能力。结果:Western blot和RT-PCR法检测GRB2被显著敲低;克隆形成和CCK8法检测GRB2敲低组的结直肠癌细胞增殖能力明显弱于对照组。结论:GRB2促进结直肠癌细胞的增殖能力。

关键词：结直肠癌 GRB2 预后不良

GRB2蛋白表达水平与结直肠癌进展和预后相关关系研究

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GRB2蛋白表达水平与结直肠癌进展和预后相关关系研究

作者：康争春第二军医大学

学位级别：硕士

关键词：结直肠癌 GRB2 预后不良