左卡尼汀对5-氟尿嘧啶诱导人胃癌细胞MGC803凋亡影响的研究

作     者：郎娟娟 

作者单位：天津医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘艳霞

授予年度：2017年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100214[医学-肿瘤学] 10[医学] 

主      题：MGC803细胞 L-CNT 5-Fu 联合用药 细胞周期 细胞凋亡 

摘      要：目的:探讨心脏保护剂左卡尼汀（levocarnitine,L-CNT）对5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-Fu）诱导MGC803细胞凋亡的影响,并初步探讨两药联合应用诱导细胞凋亡的作用机制。方法:1.L-CNT和5-Fu作用浓度的确定MTT法检测不同浓度的L-CNT、5-Fu分别作用24 h和48 h对MGC803细胞增殖的影响,根据MTT结果选择L-CNT、5-Fu的作用浓度及作用时间。L-CNT的浓度为0.08、0.8、8、16 mmol·L-1,5-Fu浓度为0.019、0.19、1.9、19、95 mmol·L-1。2.L-CNT对5-Fu诱导MGC803细胞凋亡的影响将MGC803细胞分为4个组,即阴性对照组（control）、L-CNT组、5-Fu组、L-CNT和5-Fu联合用药组（L-CNT+5-Fu）。通过倒置显微镜观察细胞形态学变化,MTT法检测细胞增殖,流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡。3.L-CNT影响5-Fu诱导MGC803细胞凋亡作用机制的研究Real-Time PCR检测MGC803细胞CPT1A、CPT1B、OCTN2和CRAT基因表达,流式细胞术PI单染检测细胞周期,Western blot法检测细胞凋亡蛋白Bcl-2、Bax、ANT1、cleaved-PARP及细胞周期蛋白cyclin D1和p21表达。结果:1.确定L-CNT和5-Fu作用浓度和作用时间MTT结果显示,L-CNT在0.08-0.8 mmol·L-1的浓度范围内随作用浓度的增大,细胞增殖率呈上升趋势,对细胞增殖有促进作用;在8-16mmol·L-1的浓度范围内随作用时间的延长和作用浓度的增大,细胞增殖率降低,对细胞增殖有抑制作用。不同浓度的5-Fu均对MGC803细胞增殖产生抑制作用。5-Fu作用24 h的IC20值为0.01 mmol·L-1,IC50值为9.01 mmol·L-1,作用48 h的IC20值为0.006 mmol·L-1,IC50值为0.81 mmol·L-1。0.01 mmol·L-1 5-Fu和不同浓度L-CNT同时作用24 h后,随着L-CNT浓度增大,细胞增殖率降低。根据MTT结果,选择L-CNT和5-Fu的作用浓度分别为0.8 mmol·L-1和0.01 mmol·L-1,作用时间为24 h。2.L-CNT增强5-Fu对MGC803细胞凋亡的诱导作用与control组相比,L-CNT（0.8 mmol·L-1）组细胞与细胞间连接紧密,轮廓清晰;细胞凋亡比例无明显变化（P0.05）。5-Fu（0.01 mmol·L-1）组及L-CNT（0.8mmol·L-1）+5-Fu（0.01 mmol·L-1）组细胞膜萎缩,胞质空泡化,细胞增殖率均显著降低（F=188.234,P0.001）;细胞凋亡率均显著增加（F=88.219,P0.001）。与5-Fu（0.01 mmol·L-1）组相比,L-CNT（0.8 mmol·L-1）+5-Fu（0.01 mmol·L-1）组细胞增殖率由66.60±3.22%降低至60.00±1.77%,细胞凋亡率由13.47±1.92%增加至19.60±1.06%（P0.001）。3.L-CNT调节细胞周期增强5-Fu对MGC803细胞凋亡的诱导作用与control组相比,L-CNT（0.8 mmol·L-1）组CPT1A、CPT1B和OCTN2基因表达均显著升高（P0.05）,CRAT表达略有增加（P0.05）;细胞周期G0/G1期细胞比例由23.69±1.10%降低至11.35±1.33%,S期细胞比例由65.30±1.35%增加至73.79±0.68%,差异均有统计学意义（P0.001）;G2/M期细胞比例由11.01±2.35%略增加至14.86±1.89%（P0.05）;细胞凋亡蛋白Bcl-2、Bax和cleaved-PARP表达都略微升高（P0.05）,Bcl-2/Bax比值由0.80±0.07略增加至0.93±0.11（P0.05）,ANT1和cyclin D1蛋白表达均显著升高（P0.01,P0.01）,p21蛋白表达无明显变化。与control组相比,5-Fu（0.01 mmol·L-1）组CPT1A、CPT1B、OCTN2基因表达均显著降低（P0.05）,CRAT表达略有增加（P0.05）。5-Fu（0.01 mmol·L-1）组和L-CNT（0.8mmol·L-1）+5-Fu（0.01 mmol·L-1）组细胞周期G0/G1期细胞百分率降低,S期细胞百分率增加,G2/M期细胞百分率降低;促凋亡蛋白Bax、ANT1、cleaved-PARP表达均显著升高（F=30.210,P0.01;F=