星斑川鲽神经激肽B基因克隆、表达及功能研究

作     者：郭湘云 

作者单位：大连海洋大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李华

授予年度：2016年

学科分类：0908[农学-水产] 09[农学] 

主      题：星斑川鲽 神经激肽B 基因克隆 原核表达 功能研究 

摘      要：神经激肽B(neurokinin B,NKB)主要由Tac3基因编码,属于速激肽家族,在中枢神经系统和周围非神经组织中广泛存在,NKB在机体的生理活动及神经系统活动中起着非常重要的作用。近年来,NKB对生殖内分泌的调控作用受到研究学者的重视,被认为是kisspeptin之外,在生殖内分泌调控中起重要作用的又一因子。目前国内外关于NKB在生殖功能调控方面的研究已经成为一个热点。星斑川鲽(Platichthys stellatus)是继牙鲆、大菱鲆以后被认为最有希望的养殖鱼类之一,将成为新的产业。本研究以星斑川鲽为实验材料,采用c DNA末端快速扩增(RACE)方法克隆Tac3基因全长c DNA序列,进行生物信息学分析和原核表达,进一步研究了Tac3基因表达特性以及相关功能。研究结果如下:1.根据实验室获得的Tac3基因中间片段设计特异性引物(GSP1和GSP2),采用RACE技术从星斑川鲽脑细胞中克隆出Tac3基因全长。该基因的c DNA全长为710 bp,5′-UTR和3′-UTR分别为72 bp和272 bp,ORF长度为366 bp,编码121个氨基酸,Gen Bank登录号是KP742474。2.生物信息学分析显示,理论分子量为14.18K Da,等电点为10.31,推测为不稳定蛋白,存在信号肽,为前面21个氨基酸残基,无跨膜区域。二级结构预测表明,α-螺旋占41.32%,β-转角占3.31%,无规则卷曲占36.36%,延伸链占19.01%;同源性比对结果显示,星斑川鲽与平鮋属纵横平鮋(Sebastes rastrelliger)的同源性最高,为88%,根据氨基酸序列构建的系统发育树分析同样表明,星斑川鲽与平鮋属纵横平鮋NKB蛋白具有较近的亲缘关系。3.将NKB的开放阅读框序列克隆到原核表达载体p ET-21a上,成功构建了原核表达载体p ET-21a/NKB;将重组载体p ET-21a/NKB转入*** BL21,IPTG诱导其表达。SDS-PEGE电泳结果表明,在14.3-20.1KDa之间有一条明亮的带,说明p ET-21a/NKB在*** BL21中成功表达。4.应用Realtime PCR方法研究Tac3基因的表达情况。结果表明,Tac3 mRNA在脑、肝脏、性腺、后肠、肾脏、脾脏和心脏等组织均有表达,在脑组织中的表达量最高,其次是肝脏和性腺;在生殖周期的不同时期里,成熟期表达量最高,退化期开始下降。5.成熟期雌性星斑川鲽腹腔注射NKB多肽,发现NKB成熟肽能显著调控星斑川鲽Gn RH、FSH、LH等基因的表达;在10ug/kg的剂量下,NKB能有效显著地提高Gn RH、LH基因的表达水平(P0.05),降低FSH表达水平(P0.05)。同样,在星斑川鲽脑组织的组织孵育实验中,NKB成熟肽对培养的脑细胞中的Gn RH、FSH、LH基因的表达也相似的调控作用。6.通过在体注射雌激素检测脑组织中Tac3和LH基因的表达变化。研究发现:在性未成熟的星斑川鲽,腹腔注射雌二醇后,Tac3和LH基因的表达量均显著提高(P0.05),且呈现时间-剂量依存关系。提示性类固醇激素对性未成熟星斑川鲽脑组织的Tac3和LH具有正反馈调控作用。