IL-10对TGF-β1刺激的大鼠肝星状细胞的活化和ERK通路的影响

作     者：陈达凡 

作者单位：福建医科大学 

学位级别：硕士

导师姓名：李建英

授予年度：2007年

学科分类：1002[医学-临床医学] 100201[医学-内科学(含：心血管病、血液病、呼吸系病、消化系病、内分泌与代谢病、肾病、风湿病、传染病)] 10[医学] 

主      题：肝星状细胞 肝纤维化 白细胞介素-10 转化生长因子β1 α肌动蛋白 细胞外信号调节激酶 

摘      要：目的:探讨大鼠原代肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)体外培养过程中,转化生长因子β1(transforming growth factorβ1 ,TGF-β1)对其活化的作用,研究白细胞介素-10(Interleukin-10,IL-10)对TGF-β1刺激的大鼠原代HSC的活化和细胞外信号调节激酶(extracelluar signal-regulated kinase ,ERK)通路的影响。 方法:雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠,预灌注后游离其肝脏,离体应用含链霉蛋白酶E、IV型胶原酶的消化液37 oC体外灌注和振荡消化,细胞悬液过滤后,经11%Nycodenz溶液密度梯度离心分离HSC。分别用台盼蓝染色排斥法和desmin免疫细胞化学法鉴定细胞活率及纯度。分离所得细胞,于无包被的塑料培养板上分别培养2、3、4、5、6、7天后予TGFβ15μg/L处理24小时,通过观察细胞的形态变化,及应用western blot法检测处理前后细胞α平滑肌肌动蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的变化,确定HSC对TGFβ1的刺激活化作用反应最敏感的时间,选择该时间的细胞作进一步的研究。进一步的实验分组进行:①空白组(C组):换用20mL/L胎牛血清/DMEM培养液;②IL-10处理组(I组):换用含20μg/L IL-10的20 mL/L胎牛血清/DMEM培养液;③TGFβ1处理组(T组):换用含5μg/L TGFβ1的20 mL/L胎牛血清/DMEM培养液;④共处理组(M组):换用含20μg/L IL-10+5μg/L TGFβ1的20 mL/L胎牛血清/DMEM培养液。处理48小时后进行指标检测。观察细胞的形态,应用western blot法检测各组α-SMA、TGF-β1Ⅱ型受体(TGF-β1 receptor typeⅡ,TβR-Ⅱ)、TGF-β1Ⅰ型受体(TGF-β1 receptor typeⅠ,TβR-Ⅰ)、ERK1/2和磷酸化ERK1/2的表达,比较相关组间的差异。 结果:成功分离大鼠原代HSC,活率在90%以上,纯度超过90%。HSC在体外培养过程中,不同培养时间对TGFβ1的刺激活化作用反应不同。TGFβ1处理后,促进培养2,3,4,5天后的HSC表达α-SMA和形态活化,以对培养第3天的细胞作用最明显,其α-SMA表达增加78.05%,而培养6,7天后的HSC的形态和α-SMA变化不明显。进一步的实验分组后,测得T组α-SMA、磷酸化ERK的表达比C组高,M组HSC表达α-SMA比T组低,而磷酸化ERK的表达与T组无明显差别。各组间的TβR-Ⅱ、TβR-Ⅰ和ERK表达无明显差异。 结论:本研究建立一种简便、有效的大鼠肝星状细胞分离方法。在体外原代大鼠HSC的培养过程中,TGFβ1可增加HSC ERK的磷酸化,促进处部分活化状态中某阶段细胞的活化,完全活化的细胞对TGFβ1的刺激活化作用不敏感。IL-10对TGFβ1刺激HSC的活化具有抑制作用,作用点不在TβR-Ⅱ、TβR-Ⅰ、ERK1/2和磷酸化ERK1/2的表达。