猪热激蛋白Gp96N端基因与猪瘟病毒E2基因重组表达及重组蛋白的免疫原性研究

作     者：龚文芝 

作者单位：中国兽医药品监察所 

学位级别：硕士

导师姓名：宁宜宝

授予年度：2015年

学科分类：090601[农学-基础兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：猪瘟病毒 E2 蛋白 Gp96N 基因 甲病毒载体 原核表达 免疫原性 

摘      要：猪瘟病毒E2蛋白是猪瘟病毒(Classical Swine Fever Virus,CSFV)的囊膜糖蛋白,可诱导动物体产生有效的免疫保护,是研究新型疫苗的主要对象。有研究表明,Gp96N端结构区的构象有α螺旋沟,该区域与抗原肽结合能力强,形成的Gp96-抗原肽复合物非常稳定,有潜在的免疫佐剂作用。本研究将Gp96N(26AA-374AA)基因与E2全长基因通过口蹄疫病毒(Foot and Mouth Disease Virus,FMDV)2A基因进行融合,然后分别采用真核和原核系统对该重组基因进行表达,并对原核表达的重组蛋白进行免疫原性的测定以探究Gp96N(26AA-374AA)蛋白与佐剂效果。首先,将甲病毒复制子载体p SFV1进行改造,加入真核CMV启动子和终止区SV40poly A序列,获得一新的表达载体p SCA,然后将EGFP基因、猪瘟病毒E2全长基因及Gp96N端与猪瘟病E2基因的融合片段分别克隆入p SCA载体中,获得p SCA-EGFP、p SCA-E2和p SCA-GE。转染后实验结果表明,p SCA-EGFP质粒能够得到有效表达,p SCA-E2、p SCA-GE能够得到表达,但是p SCA-E2、p SCA-GE质粒表达效率不高和平均荧光值偏低。其次,将E2基因与串联重组蛋白GE基因分别克隆入原核表达载体p ET-32a(+)中得到重组质粒p ET-E2和p ET-GE,转化入Rosetta(DE3)感受态细胞中,分别诱导表达获得融合有组氨酸标签的重组蛋白E2和GE,随后对重组蛋白表达条件进行优化摸索最佳表达条件,并通过梯度尿素法对重组蛋白进行粗纯化和复性;采用SDS-PAGE和Western Blotting实验对目的蛋白进行检测,结果显示表达的重组蛋白为能与抗体特异性反应的目的蛋白。最后,为了研究重组蛋白E2、GE在动物体内的免疫原性,将原核表达的重组蛋白E2、GE和兔化弱毒疫苗以及PBS通过皮下注射免疫小鼠。通过ELISA实验检测免疫鼠血清中猪瘟病毒E2蛋白的抗体水平,结果表明:重组蛋白E2、GE和兔化弱毒疫苗组均产生较高的抗体水平,但是重组蛋白GE免疫组产生的抗体水平反而低于E2重组蛋白免疫组,由此说明Gp96N基因与E2基因串联经过原核表达后可能减弱重组蛋白的免疫效果,推测Gp96N基因与E2基因串联的位置关系可能会对原核表达的重组蛋白的免疫效果产生影响。