荷花NnγGCS基因克隆、表达及功能验证

作     者：张阿慧 

作者单位：南京农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：刘兆磊

授予年度：2015年

学科分类：090706[农学-园林植物与观赏园艺] 0907[农学-林学] 09[农学] 

主      题：荷花 NnγGGS 基因克隆 表达特点 功能分析 

摘      要：荷花属睡莲科莲属挺水植物。花大、瓣型丰富且颜色艳丽,大多分布于淡水水域,抗性强,观赏价值和经济价值都较高,是深受大众欢迎的水生植物之一。本研究从荷花中克隆得到荷花谷氨酰半胱氨酸合成酶基因(NnγGCS),分析其时空表达模式,通过转化拟南芥进而研究荷花NnγGCS基因功能,从分子水平探讨荷花重金属抗性机理,为利用基因工程技术提高荷花抗逆能力提供理论依据。1.利用RACE-PCR技术从荷花’台城拂翠’的叶片中克隆谷氨酰半胱氨酸合成酶基因NnγGCS,该基因全长1801 bp,开放阅读框(ORF)1569 bp。推导的氨基酸序列具有典型的GCS2基因家族结构域。系统进化分析表明荷花γGCS属于双子叶植物类,与龙眼,百脉根亲缘关系较近。2.利用荧光定量(Real-Time PCR)技术,分析NnγGCS在荷花不同器官及镉胁迫下的表达情况。结果表明NnγGCS在荷花各器官均有表达,属组成型基因。各器官表达量从高到低依次为:嫩叶最高,其次叶柄,成熟叶,根须,剑叶,茎最低。镉胁迫下,NnγGCS在叶片和根部的表达都有不同程度的响应。不同浓度镉处理后,NnγGCS在叶片表达变化趋势相同,均为先下降后上升,且高浓度镉处理下基因表达水平更高。然而在根部,不同浓度镉处理后,NnγGCS表达变化并不相同,低浓度镉响应更快,高浓度镉反而响应迟钝。3.在200 μM和400 μMCd胁迫下,测定荷花各器官镉积累量,结果表明荷花的根须和叶片是主要的镉积累器官。叶片中镉积累量高达1000 μg/g干重。在根茎中积累量最少,仅80 μg/g干重。4.构建了荷花NnγGCS正正义表达载体,并利用基因枪轰击洋葱表皮细胞技术进行亚细胞定位实验,结果表明NnγGCS基因定位于细胞质。通过农杆菌侵染拟南芥花序法将NnγGGS基因导入拟南芥,经潮霉素抗性筛选及PCR检测,获得3株转基因株系(T1-1,T1-2,T1-3)。荧光定量结果表明T1-3中目的基因表达量最高。在含镉培养基上播种野生型和转基因拟南芥T3代种子,比较其发芽率,结果表明转基因株系发芽率高于野生型。根系生长也比野生型旺盛,生长量大于野生型。用100 μMCd处理后,野生型拟南芥膜脂过氧化程度大于转基因植株,抗氧化酶活性也高于转基因植株。