DF-1细胞分泌的外源体（Exosomes）在ALV-J免疫抑制中的作用

作     者：陈洪博 

作者单位：山东农业大学 

学位级别：硕士

导师姓名：成子强

授予年度：2011年

学科分类：090603[农学-临床兽医学] 09[农学] 0906[农学-兽医学] 

主      题：DF-1细胞 ALV-J Exosomes 相互作用 免疫抑制 

摘      要：J亚群禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus Subgroup J,ALV-J)是禽白血病/肉瘤病毒群的一个新亚群,是由英国人Payne于1991首次报道,其主要引起肉种鸡的髓细胞瘤(Myelcytomatosis,ML)。近年来ALV-J在世界范围内迅速传播,尤其是在1997-1998年对世界养禽业造成了毁灭性的打击。ALV-J是由内源性和外源性禽白血病病毒(Avian Leukosis Virus,ALV)重组而来,自发现以来给养禽业造成了巨大的经济损失。ALV-J除可导致ML并引起感染鸡群死亡外,更值得我们注意的是它的免疫抑制作用,这也是绝大数感染鸡群的主要表现形式,由于ALV-J的感染,鸡群的生产性能大为降低,对疫苗的免疫应答水平降低,导致继发感染其它疾病,引起更重大经济损失。因此,对ALV-J造成免疫抑制的机制及其相关影响因素的研究,对进一步ALV-J的防控研究具有重要意义。 自1987年Johnstone等人发现网织红细胞向成熟红细胞转变过程中释放一种名为外源体(Exosome)的微囊泡之后,Exosome已被越来越多的人进行研究。Exosome来源于细胞内吞途径中的多囊体(Multivesicularbody,MVB),它除了可由网织红细胞分泌之外,还可由诸如各种血细胞、上皮细胞、神经细胞、肿瘤细胞(如黑色素瘤、肺癌、间皮瘤、乳腺癌、卵巢癌、白血病细胞)等多种细胞分泌。近几年,研究发现Exosomes的分泌与反转录病毒出芽之间存在一定的联系,例如人巨细胞病毒(HCMV)蛋白US28主要存在于MVB中,通过HCMV病毒装配与病毒包膜组合在一起;HIV-1出芽依赖Tsg101(一种在MVB形成过程中很重要的蛋白)。反转录病毒在浆膜向外出芽方式与MVB向内出芽一样,都是胞膜包裹胞质内陷,这样反转录病毒似乎与经修饰的MVB内囊泡(比如Exosome)一样,有可能通过MVB与浆膜融合释放到细胞外环境。于是,我们推测病毒感染细胞分泌的Exosome可能携带了某些病毒蛋白,在细胞信号转导中传递了病毒的组成成分,造成细胞对病毒识别的丧失,从而使病毒能够顺利的在细胞内复制及传播。 本研究以ALV-J为模式病毒,研究其感染细胞分泌的Exosome在免疫抑制中的作用。采用分级离心和密度梯度离心的方法,从ALV-J感染DF-1细胞及正常DF-1细胞培养基中提取Exosomes,利用电镜技术和免疫印迹分析对其进行鉴定。结果显示,从DF-1细胞培养基中提取的Exosomes主要分布在1.13-1.21g/ml密度层之间,平均直径在30-100 nm之间,呈杯状,这与相关报道关于其它细胞分泌的Exosomes特征一致。分别提取等量两种细胞上清液,经BCA蛋白定量后发现ALV-J感染Exosome浓度为正常Exosome浓度的63倍,表明ALV-J感染对Exosome的分泌有重要影响。 利用免疫印迹方法,分析DF-1细胞释放ALV-J与其分泌Exosomes之间的关系。结果显示,从正常DF-1细胞和接种ALV-J的DF-1细胞系培养基中提取的Exosomes蛋白组成复杂,蛋白分子量在20-200kD之间,两种Exosome成分之间有相同之处,但也存在差异;Hsp70等标志性蛋白存在于所提取的Exosomes上;用兔抗ALV-J GP85多克隆抗体可以检测到ALV-J感染DF-1细胞Exosome出现阳性条带,条带分子量大小为70kD左右,而DF-1细胞上清液中提取的Exosome检测不到条带,表明DF-1细胞分泌的Exosome携带了病毒的SU蛋白或SU蛋白的一部分;ISU片段是TM内高度保守的免疫抑制序列,具有免疫抑制作用,能够抑制淋巴细胞的分化,用兔抗ISU肽多克隆抗体正常DF-1细胞Exosome和ALV-J感染DF-1细胞来源的Exosome均可在74kD左右出现阳性条带,表明TM蛋白ISU区域或能与ISU多肽结合的物质也包含在Exosome的囊泡内,而这种物质是正常DF-1细胞分泌的,ALV-J感染细胞后并不影响它的生成。上述结果表明,正常DF-1细胞和ALV-J感染DF-1细胞系可以分泌Exosomes,ALV-J感染DF-1细胞释放的Exosome携带有ALV-J病毒的表面蛋白和跨膜蛋白高度保守区域,根据Exosome自身所具有的远程信号传导功能,我们确定Exosome在ALV-J所造成的免疫抑制过程中起信号传递作用。